5 Gaps in Your Environmental Monitoring Program

Even the best-planned cleaning and disinfection monitoring programs have their blind spots. Stefan Widmann takes a closer look at five of the most likely – and most dangerous – gaps in your environmental monitoring program.

#1 Lebensfähige, aber nicht kultivierbare (VBNC) Mikroorganismen

Lange Zeit gingen Mikrobiologen davon aus, dass alle Bakterien, die nicht auf normalen Kulturmedien wachsen konnten, tot seien. Weiterführende Studien ergaben jedoch, dass es jenseits von kultivierbar und tot einen dritten Zustand gibt: lebensfähig, aber nicht kultivierbar (VBNC- „vialbel but non-culturable”). Im Allgemeinen vermehren sich Bakterien im VBNC-Zustand nicht, sind aber noch am Leben, was sich anhand ihrer Stoffwechselaktivität nachweisen lässt. Am wichtigsten ist für uns die Tatsache, dass sie nach der Reanimation kultivierbar werden und sich somit in Lebensmitteln vermehren können. Darüber hinaus wachsen einige pathogene Bakterien nicht in Abwesenheit eines Wirts und müssen nur in der Nahrung überleben, bis sie aufgenommen werden, um Krankheiten zu verursachen.
Es gibt viele Gründe, warum Bakterien in den VBNC-Zustand übergehen können: zum Beispiel Hunger, Inkubation außerhalb des für das Wachstum optimalen Temperaturbereichs, erhöhte osmotische Konzentration, der Grad der Sauerstoffkonzentration oder die Exposition gegenüber weißem Licht. Die spezifischen Eigenschaften des betreffenden Bakterienstammes bestimmen, was genau die Bakterien dazu veranlasst, in diesen Zustand überzugehen. 

Warum sollte Sie das interessieren?
Bestimmte Bakterien, die in den VBNC-Zustand übergehen können, sind für Lebensmittelhersteller besorgniserregend. Wir kennen zwar noch nicht alle Bakterienarten, die in den VBNC-Zustand übergehen können, aber einige schon. Sie zählen zu den Indikatororganismen (zum Beispiel Klebsiella aerogenes und Klebsiella pneumoniae), Verfälschern (zum Beispiel Lactobacillus plantarum und Lactococcus lactis) und Pathogenen (zum Beispiel Salmonella Typhimurium, Campylobacter coli oder Listeria monocytogenes).
Nachdem wir sie identifiziert haben, müssen wir uns nun fragen, ob diese Bakterien in einen vollständig kultivierbaren und potenziell pathogenen Zustand zurückkehren könnten. Mikrobiologen tappten bei dieser Frage lange im Dunkeln, da es schwierig ist, VBNC-Bakterien vollständig von kultivierbaren Bakterien zu trennen. Die Forscher haben dieses Problem zum Teil durch einen statistischen Ansatz gelöst: Sie verdünnten eine hohe Anzahl von VBNC-Bakterien so weit, dass es für kultivierbare Bakterien nahezu unmöglich ist, zu überleben. Die Bakterien wurden dann nach einem definierten Zeitraum gezählt. Bei einem starken Wachstum ist die einzig mögliche Schlussfolgerung, dass die Bakterien den VBNC-Zustand verlassen haben und kultivierbar geworden sind. Eine weitere Begleiterscheinung ist, dass sie, wenn sie in einen kultivierbaren Zustand zurückkehren können, auch wieder pathogen werden können. Es gibt Beispiele dafür, dass genau dieses Phänomen zu Ausbrüchen führt. Beispielsweise wurde das VBNC-Bakterium E. coli O157 bei einem Ausbruch in Japan im Jahr 1997 vermutet, da die Gesamtzahl der E. coli zu gering war und shigatoxigene Stämme wie O157 bereits in sehr geringer Zahl Krankheiten verursachen können.
 

#2 Anaerobe und mikroaerophile Bakterien

Anaerobe Bakterien oder allgemeiner anaerobe Mikroorganismen lassen sich in drei Gruppen einteilen: obligat, aero-tolarant und fakultativ. Wie der Name schon sagt, haben sie jeweils besondere Anforderungen an die Luft, genauer gesagt an den Sauerstoff, der sie umgibt. Obligate Anaerobier wie Clostridioides difficile werden durch Sauerstoff geschädigt und sterben kurz nach der Exposition ab. Aero-tolerante Bakterien wie Clostridium botulinum können Sauerstoff nicht verwerten und sterben bzw. wachsen in seiner Gegenwart nicht. Fakultative Anaerobier können Sauerstoff nutzen, brauchen ihn aber nicht zum Wachstum, wie zum Beispiel E. coli. Es gibt auch die Gruppe der mikroaerophilen Bakterien wie Campylobacter, die Sauerstoff zum Wachstum benötigen, wenn auch in viel geringeren Mengen (1-2%) als in normaler Luft, die aber unter aeroben Bedingungen gehemmt werden können.  

Warum sollte Sie das interessieren?
Es gibt mehrere pathogene Bakterien, die diese speziellen Wachstumsanforderungen haben. Derzeit bereiten thermotolerante Campylobacter-Arten den Fachleuten im öffentlichen Gesundheitswesen Sorgen. Im Durchschnitt ist jedes zweite Huhn mit Campylobacter infiziert, was Geflügelfleisch zu einer der häufigsten Ursachen für Lebensmittelvergiftungen macht. In der EU treten Krankheiten, die durch Campylobacter-Arten verursacht werden, doppelt so häufig auf wie Krankheiten durch Salmonella. Aus der Gruppe der anaeroben Bakterien ist eine Clostridienart wie C. botulinum für die Lebensmittelvergiftung Botulismus verantwortlich, die häufig durch (sauerstoffarme) Konserven übertragen wird, in denen C. botulinum gedeihen und den für den Menschen giftigen Stoff Botulinum produzieren kann. Eine weitere Clostridienart, C. perfringens, ist in den USA und Kanada die häufigste Quelle für Lebensmittelvergiftungen und verursacht Symptome wie Bauchkrämpfe und Durchfall. Das Risiko einer Infektion mit C. perfringens korreliert besonders stark mit Lebensmitteln, die über längere Zeiträume warm gehalten oder gelagert werden, was das Anwachsen der Bakterien auf eine infektiöse Zahl begünstigt (104 cfu/g).

 

#3 Die große Keimzahlanomalie

Es wird geschätzt, dass mit den uns derzeit zur Verfügung stehenden Kenntnissen und Techniken nur 1% der Bakterien kultiviert werden kann. Mit der „Keimzahlanomalie“ bezeichnen wir die Beobachtung, dass die mikroskopischen Zellzahlen signifikant höher sind als die entsprechenden Zahlen der „koloniebildenden Einheiten“ auf Agarplatten. Ein Beispiel kann dieses Phänomen am besten veranschaulichen: Während 50% der Mikroorganismen der Mundflora mit Agarplatten kultiviert werden können, kann der größte Teil der Darmflora überhaupt nicht kultiviert werden. Die Gründe dafür sind zahlreich, aber eine wichtige Rolle könnte die das betreffende Bakterium umgebende Organismengemeinschaft, einschließlich anderer Bakterien, Pflanzen und Tiere, spielen.
Aerobe Keimzahlmethoden beruhen auf sehr allgemeinen Medien, die das Wachstum der meisten Bakteriengruppen nicht unterstützen. Technisch gesehen gehört dieses Problem nicht wirklich zur großen Keimzahlanomalie, da einige Bakterien unter besonderen Bedingungen (wie anaeroben oder mikroaerophilen Bedingungen) auf speziellen Agarplatten wachsen können.

Warum sollte Sie das interessieren?
Die große Keimzahlanomalie stellt im täglichen Testbetrieb kein wesentliches Problem dar, da die aerobe Keimzahl spezifisch für Indikator-Mikroorganismen einer bestimmten Produktionsumgebung ist und daher immer im Verhältnis zu den für diese Produktionsumgebung geltenden Ausgwangswerte sowie der festgelegten Baseline steht. Plattenverfahren sind jedoch sehr zeitaufwendig und erfordern je nach Protokoll eine Inkubationszeit von bis zu drei Tagen. Es gibt auch direkte Methoden ohne Kultivierungsschritt zur Zählung der Bakterien: Mikroskope bieten einen umfassenden Überblick über die Bakterien, sind aber sehr zeitaufwändig. Direkte Methoden wie die Durchflusszytometrie sind zwar in Wasseraufbereitungsanlagen üblich, jedoch in der Lebensmittelindustrie noch nicht verbreitet.

 

#4 Psychrotrophe Bakterien

Psychrotrophe Bakterien sind Bakterien, die bereits bei Temperaturen um die 0 °C wachsen können, aber deren optimale und maximale Wachstumstemperatur über 15 °C liegt. Diese Eigenschaft macht derartige
Mikroben besonders problematisch für Lebensmittel und Getränke wie rohes Fleisch und Milch, die längere Zeit bei niedrigen Temperaturen gelagert werden.
Die am häufigsten in Lebensmitteln vorkommenden psychrotrophen Bakteriengruppen sind die gramnegativen Gattungen Pseudomonas, Aeromonas, Achromobacter, Serratia, Alcaligenes, Chromobacterium und Flavobacterium sowie grampositive Gattungen wie Bacillus, Clostridium, Corynebacterium, Streptococcus, Lactobacillus und Mikrobakterien. Es ist auch bekannt, dass sich Listeria monocytogenes und einige Stämme von Clostridium botulinum bei Kühltemperaturen vermehren können..

Warum sollte Sie das interessieren?
Psychrotrophe Bakterien sind Verderborganismen und können die Qualität und die Haltbarkeit von Lebensmitteln erheblich beeinträchtigen. Gekühlte Produktionsanlagen und Lagertanks bieten die perfekte Umgebung für die Vermehrung dieser Bakterienarten. In gekühlter Milch zum Beispiel können Pseudomonas fluorescens sowohl Proteasen als auch Lipasen produzieren. Daher sind Pseudomonas-Arten typischerweise für technologische Schwierigkeiten verantwortlich, da die von ihnen produzierten Proteasen und Lipasen den Abbau von Milchfett und Proteinen verursachen können, was der Milch eine gräuliche Farbe und einen bitteren Geschmack verleiht. Pseudomonas-Arten sind auch die Mikroorganismen, die am häufigsten für den Verderb von aerob gelagertem Kühlfleisch verantwortlich sind. Es ist bekannt, dass Pseudomonas-Arten sehr robust sind und belastenden Umweltbedingungen, die das Wachstum anderer verderbender Mikroorganismen hemmen würden, standhalten können. In vakuumverpacktem, gekühltem Rohfleisch wird die Mikroflora in den meisten Fällen von psychrophilen Milchsäurebakterien dominiert. Außerdem kann das Wachstum von Krankheitserregern während der Kühllagerung zu schweren Erkrankungen führen.

 

#5 Biofilme

Mikroorganismen können Oberflächen besiedeln, indem sie eine polymere Matrix bilden, in der mehrere mikrobielle Spezies vorhanden sein können. Dies wird als Biofilm bezeichnet. Es ist erwiesen, dass die Fähigkeit, Biofilme zu bilden und darin zu überleben,nicht auf bestimmte Gruppen von Mikroorganismen beschränkt ist. Vielmehr ist die große Mehrheit der Bakterien in der Lage, Biofilme zu bilden. Biofilme können daher entweder aus Monokulturen oder aus mehreren verschiedenen Mikroorganismenarten bestehen. Einige Forscher vermuten, dass die komplexe Struktur gemischter Biofilme diese stabiler und widerstandsfähiger gegen Reinigungschemikalien macht. Die erste Population, die sich an die Oberfläche bindet, kann die Eigenschaften dieser Oberfläche verändern, sodass die später hinzukommenden Mikroorganismen durch Zell-Zell-Assoziation anhaften können. In einigen Fällen kann das Anhaften einer zweiten Art die Stabilität der Biofilmpopulation sogar noch erhöhen. Studien zeigen beispielsweise, dass L. monocytogenes in Anwesenheit von Pseudomonas eher an Stahl anhaftet.

Warum sollte Sie das interessieren?
Biofilme in lebensmittelverarbeitenden Anlagen und auf anderen Oberflächen, die mit Lebensmitteln in Berührung kommen, stellen eine dauerhafte Kontaminationsquelle dar, die die Gesamtqualität und Sicherheit von Lebensmitteln gefährdet und möglicherweise zu lebensmittelbedingten Krankheiten sowie zu wirtschaftlichen Verlusten führt. Verderbniserreger sind bekanntermaßen für fast ein Drittel der Verluste in der Lebensmittelversorgungskette verantwortlich, weshalb die Vermeidung und Kontrolle von Biofilmen in der Lebensmittelindustrie eine Priorität darstellt. Mikroorganismen, die Biofilme bilden oder darin gedeihen, sind widerstandsfähiger gegen Desinfektion, was sie in vielen Bereichen der Lebensmittelindustrie problematisch macht. Andere Auswirkungen von Biofilmen, wie die Korrosion von Metalloberflächen, sind ein weiteres kritisches Thema in der Lebensmittelindustrie. In jedem Fall stellt das Vorhandensein von Biofilmen in einer Lebensmittelfabrik ein Risiko für die menschliche Gesundheit dar. Das Ausmaß des Risikos hängt von den Bakterienarten ab, die diese dreidimensionale, lebende Struktur bilden..

Wie kann man diese Schwachstellen beseitigen? Das Potenzial der Durchflusszytometrie
Lebensmittelhersteller haben im Allgemeinen nicht viele Möglichkeiten. Verfahren, die ein gewisses Maß an Präzision bieten, wie z. B. die Vitalfärbung in Kombination mit Mikroskopen, können VBNC-Bakterien quantifizieren, sind jedoch zeitaufwändig und erfordern eine spezielle Ausrüstung. Alle Gruppen von anaeroben und mikroaerophilen Bakterien – mit der bemerkenswerten Ausnahme der fakultativen Anaerobier – können auf klassischen Agarplatten wachsen, allerdings nur unter sorgfältig kontrolliertem Sauerstoffgehalt.
Agarplatten sind jedoch keine Patentlösung. Auf Agarplatten können nur etwa 1 % der bekannten Bakterienarten gezählt werden und es dauert Tage, bis die Ergebnisse vorliegen – im Falle psychrotropher Bakterien bis zu 10 Tage. ATP-Methoden sind zwar schnell, quantifizieren aber keine Bakterien und sind nur begrenzt geeignet, um Bakterien in Biofilmen nachzuweisen. Die kinetischen Daten von frei schwebenden planktonischen Zellen sollten nicht als Referenz verwendet werden, da die ATP-Freisetzung in Biofilmen viel geringer ist. Außerdem können ATP-Spuren von Lebensmittelresten oder Pilzen das von Bakterien freigesetzte ATP leicht überschatten, da eukaryotische Zellen 10 Millionen Mal mehr ATP enthalten als prokaryotische Zellen. Dementsprechend haben ATP-Geräte zum Nachweis von Biofilmen in der Regel eine viel höhere Nachweisgrenze, was bedeutet, dass sie nicht so empfindlich sind, wie sie es beim Nachweis frei schwimmender Bakterien wären. Diese fünf Aspekte zeigen, wie schwierig es sein kann, Bakterien und Rückstände auf Oberflächen in der Lebensmittelproduktion nachzuweisen. Außerdem sind die Unzulänglichkeiten der gebräuchlichsten Nachweismethoden, wie z. B. Kulturmethoden und ATP-Tests, ebenso konsistent wie gut dokumentiert.
Was können Lebensmittelhersteller tun, um die Schwachstellen von Kulturmethoden und ATP-Tests zu umgehen? Im nächsten Artikel erörtert mein Kollege Cristian Ilea das Potenzial der Impedanz-Durchflusszytometrie und des CytoQuant®-Durchflusszytometers – einer neuen Lösung, die Bakterien und Partikel auf Oberflächen sofort quantifiziert. 

This article was published in Spot On #15

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