Alternativen zu immunbasierten Allergentests

ELISA, Teststreifen, PCR oder Massenspektrometrie – gibt es die perfekte Testmethode für Allergene? Kurt Brunner diskutiert die Vor- und Nachteile der verschiedenen Möglichkeiten.

Die meisten kommerziell erhältlichen Testkits für Lebensmittelallergene beruhen auf der Verwendung von immunbasierten Methoden, wie ELISA oder Lateral Flow Systemen (Teststreifen). Um einen ELISA durchzuführen, wird zwar geschultes Personal benötigt, aber durch die Verwendung von 48-Well oder 96-Well Mikrotiter-Platten können zahlreiche Proben gleichzeitig analysiert werden. Im Allgemeinen kann so eine Analyse zwischen 30 Minuten und einigen Stunden dauern.
Derzeit ist der ELISA die am weitesten verbreitete Methode für die Detektion und Quantifizierung von Lebensmittelallergenen. Jedoch kann man, obwohl viele Proben gleichzeitig analysiert werden können, die Proben jeweils nur auf ein bestimmtes Allergen testen.

Zu beachtende Limitierungen

Aufgrund der hohen Spezifität eines Antikörpers gegenüber nur einem bestimmten allergenen Protein und weiteren Limitierungen bedingt durch die Technologie, muss für jedes Allergen ein separates Testsystem verwendet werden. Zudem kann der hohe Grad an Spezifität gegenüber einem Allergen auch zu falsch negativen Ergebnissen führen.
Lebensmittelverarbeitungsschritte, wie Hitzebehandlung, der Zusatz saurer Verbindungen oder Fermentation können die Struktur des Zielproteins verändern. Diese modifizierten Allergene können ihre immunologischen Eigenschaften verlieren und der Antikörper-Protein-Komplex kann nicht mehr gebildet werden. Das führt zu falsch negativen Resultaten oder zu niedrigen Messergebnissen.
Streifentests sind kostengünstig, sehr einfach in der Anwendung, benötigen keine Laborgeräte und zeigen das Ergebnis üblicherweise innerhalb weniger Minuten an. Allerdings sind die meisten Streifentests nur qualitativ und sind ebenfalls auf Antikörper als Detektionselemente angewiesen. Aus diesem Grund haben sie bei hoch prozessierten Lebensmitteln mit denselben Problemen zu kämpfen wie ELISA-Tests.
In den letzten Jahren wurden alternative Analysenmethoden entwickelt, um zumindest ein paar der Einschränkungen von Immunbasierten Testsystemen zu umgehen.

Allergendetektion mittels PCR

Die PCR (Polymerase-Kettenreaktion) ist eine relativ schnelle und günstige Methode zur Identifizierung von DNA. Die Technologie hat sich seit ihrer Entwicklung in den 1980er Jahren stetig verbessert. Inzwischen wird die PCR seit vielen Jahren in den Bereichen der medizinischen Diagnostik, Forensik und Umweltüberwachung und zur Quantifi zierung genetisch veränderter Organismen in Lebens- und Futtermitteln verwendet. In den frühen 2000er Jahren wurde die PCR zum ersten Mal eingesetzt, um die DNA sehr bekannter Lebensmittelallergene, wie Haselnüsse oder Erdnüsse, zu identifizieren. Bis zum heutigen Tag wurden PCR Testmethoden für die meisten der „Big Eight“ Allergene in den USA und der 14 kennzeichnungspflichtigen Allergene in der EU veröffentlicht.
Bei der PCR werden kleine Fragmente einer Ziel-DNA so lange vervielfältigt, bis eine ausreichende Anzahl an Kopien für die Visualisierung oder Quantifizierung vorhanden ist. Das Zielfragment der Analyse wird dabei um den Faktor 107 bis 109 vervielfacht, sodass die wenigen Moleküle der Ziel-DNA in ausreichender Menge vorhanden sind, um allergene Inhaltsstoffe erfolgreich zu detektieren.
Ursprünglich wurde die PCR als qualitative Methode entwickelt, aber später wurde sie so modifiziert, dass nun mit Hilfe von Fluoreszenzfarbstoffen oder speziellen Sonden auch eine quantitative Analyse möglich ist.
Die Tatsache, dass die PCR das extrem stabile DNA-Molekül detektiert, kann für die Analyse von hoch prozessierten Lebensmitteln ein Vorteil sein. DNA verändert sich meist auch unter extremen Bedingungen nicht und kann daher immer noch nachgewiesen werden, wenn die meisten Proteine schon abgebaut oder verändert wurden. Außerdem kann die PCR für Allergene wie Sellerie verwendet werden, die nicht durch Antikörper detektiert werden können. Sellerie ist kennzeichnungspflichtig in der EU, aber bisher sind alle Versuche einen verlässlichen Antikörper zu produzieren an der engen Verwandtschaft zwischen Sellerie und anderen Pflanzen, wie Petersilie, Karotten, Koriander oder Fenchel gescheitert.
Während der letzten Jahre wurden auch neuere DNA-Detektionsmethoden entwickelt. Alle diese sogenannten isothermalen Amplifikationstechniken sind bis zu einem gewissen Grad mit der konventionellen PCR verwandt, können aber mit minimaler Geräteausstattung durchgeführt werden.
Ein einfacher Heizblock wird für die Vervielfältigung der Ziel-DNA verwendet und der anschließende visuelle Nachweis wird durch Fluorenszenzfarbstoffe ermöglicht. Die isothermale Amplifikation ist üblicherweise nicht nur schneller als die PCR, sondern auch weniger anfällig für Verunreinigungen aus dem Probenmaterial und in vielen Fällen ist sie auch sensitiver.

PCR Analysis

Figure 1. A simplified scheme of PCR analysis

Why DNA techniques might fail

Although the detection of the DNA of allergenic food compounds might have some advantages over immuno- based methods, this approach suffers from some severe drawbacks. As DNA is the analyte of choice for PCR, it is difficult/ impossible to discriminate between egg or milk and the corresponding tissue DNA of chicken or cow as share identical DNA.
Some samples like egg white or milk only contain minor amounts of DNA but a lot of allergenic proteins and therefore, this method is not suitable for analyzing such types of samples.

Mass spectrometry: a high-end technology

An even newer technology for detecting and quantifying allergens is mass spectrometry, a high-tech method that identifies proteins and peptides with a very high level of accuracy. The first attempts at applying this technology to allergen detection began in the late 1990s but most of the results were only published in the last few years. The main benefit of using this technology for allergen testing is the high level of confidence and reliability. The instruments have the capability of detecting multiple peptides per protein. Ideally, two to three fragment peptides are analyzed per allergen. The advantage of this approach is that even if proteins are partially degraded or modified due to harsh food processing conditions, the probability of finding at least one intact fragment is quite high. These marker peptides are selected from databases or from literature and must be highly specific for the allergens to be quantified. Furthermore, they are chosen to be resistant to food processing alterations.
This multi-peptide recognition strategy of the allergen is not possible with immuno-based assays. Antibodies usually bind to only one particular (immunogenic) fragment of the allergen. If this small fragment is modified, the recognition of the target might be hampered.
Additionally, mass spectrometry is able to measure several allergens in parallel. These multi-analyte methods have become particularly popular in recent years. This innovative strategy allows a single extraction of a sample to be screened for numerous allergens in a single analysis run. The extraction procedure for mass spectrometry analysis is more laborious than for other approaches. First, the sample is mixed with an extraction buffer often containing dithiothreitol or urea to create a reducing environment that breaks up disulfide bonds of proteins. The remaining sample residue is then removed by centrifugation and the linearized proteins are cleaved with digestion enzymes. Some hours or an overnight duration is required to cut the allergenic proteins with these enzymes into small peptide fragments. Although the preparative steps are time consuming, the resulting peptide solution can then be analyzed for several allergens in parallel using the mass spectrometer. Current multi-methods can quantify up to seven allergens in parallel, but it can be expected that this number might increase dramatically over the next few years. Mycotoxin multi-analyte methods started with a few analytes only some 10 years ago and today, the most advanced assay designs are capable of analyzing more than 400 toxins in parallel.

Workflow Mass Spectrometry

Figure 2. Workflow in mass spectrometry

The best method?

Mass spectrometry can probably be considered the allergen testing method having the most potential for future improvements due to its outstanding reliability, sensitivity and the potential to perform multi-allergen analysis.

However, there is no approach without drawbacks. Mass spectrometry needs highly skilled personnel and the initial investment costs are high due to the expensive instrumentation. Furthermore, the time to result will always be much longer than for immuno methods.

No one-size-fits-all

The perfect method, a gold standard for allergen quantification, does not exist. ELISA and LFDs are the method of choice for the majority of industrial applications. Results can be obtained relatively quickly, costs are moderate to low and personnel can be easily trained to use these tests. For some problems like highly processed testing material or specific analytes, PCR might lead to better results. Mass spectrometry is situated at the upper end of available technologies but is still in its infancy for allergen testing. However, it has, in recent years, become the method of choice for many other analytical challenges. It can be expected that this technology might experience a boost in the field of allergen analysis in near future.