Herstellung von flüssigen Mykotoxin-Standards: Ein Blick hinter die Kulissen

Viele akkreditierte Labore verwenden Referenzmaterialien, um die Rückverfolgbarkeit und Zuverlässigkeit ihrer Analyse-Ergebnisse zu demonstrieren. Weniger bekannt ist, wie Referenzmaterialien hergestellt werden.

Referenzmaterialien oder Kalibrierstandards beschreiben Stoffe oder Gegenstände mit einer oder mehreren definierten, charakteristischen Eigenschaften, die als Referenz für Messverfahren verwendet
werden. Angesichts des Verbraucherschutzes bei Lebensmitteln und Futtermitteln, beinhaltet die Überwachung von Mykotoxinen die Verwendung von Referenzmaterialien, um genaue und zuverlässige
Ergebnisse zu erhalten.

Allgegenwärtige Gefahr

Mykotoxine sind natürlich vorkommende Sekundärmetaboliten von Pilzen und giftig für Tiere und Menschen. Schimmelpilze wachsen sowohl auf dem Feld als auch während der Lagerung. Ihre Metaboliten werden in fast allen landwirtschaftlichen Rohstoffen weltweit gefunden. Es sind über 380 Mykotoxine bekannt, deren Toxizität sehr unterschiedlich sein kann. Die zulässigen Höchstkonzentrationen von verschiedenen Mykotoxinen in pflanzlichen Rohstoffen wie Getreide, Weizen und Mais zwingen Rohstoffproduzenten, ihre Proben in analytischen Laboren untersuchen zu lassen und so die Qualität ihrer Produkte zu überprüfen.

Gravimetrische Aufbereitung

Pilze, die unter optimalen Bedingungen (warme Temperaturen, hohe Luftfeuchtigkeit und ein geeignetes Substrat) wachsen, produzieren häufig Mykotoxine. Unter Laborbedingungen beginnt die Herstellung von Referenzmaterial mit dem Versuch, die künstlichen Wachstumsbedingungen zu optimieren, um maximale Mykotoxinerträge zu erzielen. Dazu zählt die Verwendung eines geeeigneten Pilzstamms, da jeder Pilz seine eigenen charakteristischen Metaboliten produziert, teilweise an die hundert verschiedene. Die ständige Überprüfung der ausgewählten Pilzstämme ist entscheidend für die Produktion. Ihre Vitalität und Funktionalität werden dazu ständig überwacht.

Schimmelpilze sind lebende Organismen, die im Laufe der Zeit mutieren oder sogar degenerieren können und so zu sinkenden Mykotoxinerträgen führen. Neue Metaboliten können nach einer gewissen Lagerzeit gebildet werden, die den Isolierungsprozess immens beeinflussen. Die Stämme werden daher regelmäßig erneuert, um Mutationen, Verunreinigungen oder anderen unerwünschten Nebeneffekte entgegenzuwirken.

Der erste Herstellungsschritt, die Fermentation, versucht dem Pilz die Laborumgebung buchstäblich so schmackhaft wie möglich zu machen, um sein Wachstum optimal zu fördern. Das Medium variiert von Stamm zu Stamm, genauso weitere Komponenten wie Salze und Mineralien, die als Quelle von Nährstoffen zur Verfügung gestellt werden. Die Pilze wachsen eine gewisse Zeit – von einigen Tagen bis wenigen Wochen – unter diesen optimierten Bedingungen. Während dieser Periode metabolisiert der Pilz das Medium und produziert die Mykotoxine.

Im Anschluss an die Fermentation findet nach sorgfältiger Kontrolle des Prozesses die Extraktion des Mykotoxin aus dem Kulturmaterial mit einem geeigneten organischen Lösungsmittel statt. Abhängig von der molekularen Struktur des Mykotoxins kann dies ein polares oder unpolares Lösungsmittel sein. Der daraus resultierende grobe Extrakt enthält neben dem gesuchten Toxin häufig noch weitere Metaboliten und Verunreinigungen wie Farbstoffe, Öle, etc. Durch verschiedene chromatographische und präparative Verfahren unterschiedlicher Selektivität wird das gesuchte Mykotoxin dann Schritt für Schritt näher an das angestrebte Ziel einer Reinheit > 98 % gereinigt und isoliert.

Einige Mykotoxine haben günstige molekulare Strukturen und können aus einer gesättigten Lösung in polaren oder unpolaren Lösungsmitteln kristallisiert werden. Dies geschieht z. B. durch Kühlen oder Verdampfen des Lösungsmittels oder durch das Mischen von verschiedenen Lösungsmitteln unterschiedlicher Polarität. Andere Toxine können durch Gefriertrocknung in eine kristalline, pulvrige Form überführt werden. Die Kristallisation stellt einen weiteren Aufreinigungsschritt dar, der die Reinheit des Toxins weiter vergrößert.

Abbildung 1. Produktionsweg

Qualitätskontrolle

UV-Spektrometrie, HPLC und HPLC-MS werden verwendet, um die Reinheit der produzierten Rohstoffe zu bestimmen. Abhängig von dem Toxin kann dies zum Beispiel durch HPLC in Kombination mit UV-Detektion, Fluoreszenz-Detektion oder ähnlichem, mit UV-Photometer (qualitative und quantitative Analyse der Verbindung) oder durch HPLC kombiniert mit Massenspektrometrie geschehen.
Massenspektrometrie ist besonders für die oben beschriebene Bestimmung der Reinheit (z.B. > 98 % 13C-Atome) von 13C Isotop-markierten Mykotoxinen erforderlich. Es ist manchmal schwierig im Handel Produkte zu finden, die zur Prozesskontrolle im Rahmen der Produktions- und Qualitätskontrolle einsetzbar sind.

Tabelle 1 zeigt, welche Schwierigkeiten bei der Herstellung und Qualitätskontrolle entstehen können
und welche Lösungen Romer Labs gefunden hat.

Tabelle 1. Herausforderungen

Versand

Nach dem Bestehen der letzten Qualitätskontrolle werden die kristallinen Mykotoxine gelöst und als gebrauchsfertiges Referenzmaterial in Fläschchen abgefüllt. Das Analysezertifikat wird für jede Charge erstellt, mit Angabe aller Eigenschaften und der Berechnung des Unsicherheitswertes, und begleitet jeden einzelnen Kalibrator.

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