Impedance Flow Cytometry and Its Use in Monitoring Food Processing Environments

What is flow cytometry, how does it work, and what application could it have in the monitoring of food processing environments? Florin Soptica and Stefan Widmann answer these questions and more.

Was ist die Durchflusszytometrie?

Bakterien (in rot) und Partikel fließen durch die
mikrofluidische Durchflusszelle des Zytometers.

Der Begriff Durchflusszytometrie bezeichnet mehrere Methoden, bei denen ein Laser oder ein elektrisches Feld verwendet wird, um bestimmte physikalische oder chemische Eigenschaften von Zellen und Partikeln, die in einer Flüssigkeit suspendiert sind, zu erkennen und zu messen. Im Idealfall fließt jeweils nur eine Zelle durch die mikrofluidischen Durchflusszelle des Zytometers, die die Veränderungen der Wellenlänge des Lichts oder der elektrischen Ladung beim Durchgang jeder Zelle oder anderer Partikel erfasst. Da die Durchflusszytometrie in der Regel große und teure Geräte sowie anspruchsvolle Vorbereitungsschritte erfordert, war die Methode bisher auf den Einsatz im Labor für Anwendungsbereiche wie Forschung und Medizin beschränkt.

 

Einsatz der Impedanz-Durchflusszytometrie zur Zählung von Zellen und Partikeln

Mikroelektroden in der mikrofluidischen Durchflusszelle erzeugen elektrische Felder mit hohen und niedrigen Frequenzen.
Bakterien und Partikel beeinflussen das elektrische Feld, wenn sie zwischen den Elektroden strömen.
Der einzigartige Fingerabdruck der Bakterien: Nur bei hohen Frequenzen kann das elektrische Feld die Zellmembran der Bakterien durchdringen. Bei niedrigen Frequenzen wird dies durch die isolierende Eigenschaft der Membran verhindert
 

Die Impedanz-Durchflusszytometrie ist abgeleitet von der Technologie der Coulter-Partikelzähler, die in Elektrolyten suspendierte Partikel anhand von Impedanzänderungen, die durch die Verdrängung der Elektrolyte durch die Partikel verursacht werden, messen und zählen können. Durch die gleichzeitige Messung mehrerer Frequenzen für jeden vorbeiströmenden Partikel kann die Impedanz-Durchflusszytometrie die Partikel nicht nur anhand ihrer Größe, sondern auch anhand ihrer elektrischen Eigenschaften unterscheiden. Dies ist eine leistungsstarke Variante der Durchflusszytometrie, da sie sehr robust ist und zur Bewertung zellulärer Merkmale verwendet werden kann, die ohne die Verwendung molekularer Marker nicht messbar sind, wie z. B. die Integrität der Zellmembran. Anstelle eines Lasers verwenden Impedanz-Durchflusszytometer daher einen Wechselstrom mit unterschiedlichen Frequenzen, der es dem Gerät ermöglicht, Zellen mit intakter Membran und Partikel getrennt zu erkennen, ihre Größe zu messen und separat zu zählen. Im Vergleich zu anderen Durchflusszytometerarten sind Impedanz-Durchflusszytometer leicht, tragbar und batteriebetrieben, so dass sie überall dort eingesetzt werden können, wo die Probe entnommen wird. Wie können Impedanz-Durchflusszytometer zwischen Zellen und anderen Partikeln unterscheiden?
Die Impedanz-Durchflusszytometrie macht sich die einzigartigen elektromagnetischen Eigenschaften der Zellmembran und des Zytoplasmas zunutze, um Bakterien von anderen Partikeln zu unterscheiden. Die Zellmembran und das Zytoplasma einer Zelle beeinflussen das elektrische Feld auf eine Weise, die sich von der anderer Partikel in der Probe unterscheidet. Ein Beispiel mit leitenden Partikeln, nicht leitenden Partikeln und intakten Zellen kann dieses Prinzip am deutlichsten veranschaulichen: Unabhängig von der Frequenz des elektrischen Feldes lässt die Leitfähigkeit metallischer (leitend) Partikel das elektrische Feld ungehindert passieren. Im Gegensatz dazu behindern nicht leitende Partikel wie Polystyrol das elektrische Feld; der Strom bewegt sich nur im flüssigen Medium, was zu einer messbaren Feldverschiebung führt, die mit der Größe der Partikel in der Durchflusszelle korreliert. Intakte Zellen sind jedoch insofern einzigartig, als dass sie je nach Frequenz des elektrischen Feldes nichtleitenden und leitenden Partikeln ähneln. Bei niedrigen Frequenzen verhindert die isolierende Eigenschaft der Zellmembran, dass das elektrische Feld in die Zelle eindringt, was zu der gleichen Art von Verschiebung wie bei nichtleitenden Partikeln führt. Bei höheren Frequenzen kann die Membran jedoch teilweise durchdrungen werden, so dass die Zellen eine ähnliche Leitfähigkeit wie metallische Partikel aufweisen. Die Mikroelektroden in Impedanz-Durchflusszytometern erzeugen sowohl bei niedrigen als auch bei hohen Frequenzen Felder, die es dem Gerät ermöglichen, diese Leitfähigkeits- und Widerstandsänderungen zu erkennen und sie in genauer Anzahl entweder Partikeln oder intakten Zellen zuzuordnen. Der Detektor identifiziert das Objekt auf der Grundlage des unterschiedlichen Grades der Impedanz oder Leitfähigkeit bei diesen Frequenzen als Bakterium. Der Benutzer erhält dann getrennte Zählungen von intakten Zellen und Partikeln.

 

Wie lässt sich die Impedanz-Durchflusszytometrie mit Kulturmethoden vergleichen?

Kulturmethoden, insbesondere Agarplatten, sind der traditionelle Ansatz zur Überwachung der Hygiene in der Lebensmittelverarbeitung.
Diese sind zwar gut etabliert, haben aber mehrere Nachteile in Bezug auf ihre Geschwindigkeit und ihren Umfang. Kulturmethoden sind langsam und benötigen zwischen einem und zehn Tagen, bis sich Bakterien zu zählbaren Kolonien entwickelt haben. Mit diesen Methoden wird nur das gemessen, was unter den spezifischen Bedingungen eines bestimmten Testlaufs kultivierbar ist: Es kann also sein, dass eine bestimmte Bakterienart einen bestimmten Agar oder ein bestimmtes flüssiges Medium bei einer bestimmten Temperatur, einer bestimmten Lichtmenge oder einer bestimmten Luftfeuchtigkeit benötigt, um zu wachsen. Kulturmethoden können auch keinen Anspruch auf eine umfassende Messung aller Bakterien in einer Probe erheben. Die „Great Plate Count Anomaly“, ein in der Mikrobiologie bekanntes Phänomen, besagt, dass nur ein kleiner Teil der Bakterien in einem Habitat durch Kultivierung erfasst werden kann. Bakterien in einem lebensfähigen, aber nicht kultivierbaren Zustand (VBNC) sind lebendig, können aber aufgrund von Stress, Eigenheiten oder nicht optimalen Umweltfaktoren nicht auf Agar oder in flüssigen Medien wachsen. In einigen Fällen können sie nach der Wiederbelebung kultiviert werden, was wiederum zeitaufwendig ist. Von einigen pathogenen Bakterien wie E. coli O157 ist bekannt, dass sie in einen VBNC-Zustand übergehen, um sich dann in späteren Stadien der Nahrungskette oder im menschlichen Wirt nach der Aufnahme zu vermehren. Außerdem benötigen anaerobe und mikroaerophile Bakterien keinen Sauerstoff bzw. einen Sauerstoffgehalt, der unter dem der normalen atmosphärischen Bedingungen liegt. Die kultivierbaren Bakterien in diesen Gruppen erfordern besondere Inkubationsbedingungen, was die Kosten der Analysen erhöht.
Impedanz-Durchflusszytometer zählen alle Bakterien, die die Durchflusszelle passieren, unabhängig von ihrem Zustand (kultivierbar, VBNC, nicht kultivierbar, ruhend) oder ihren Wachstumsanforderungen. Diese direkte, unmittelbare Quantifizierung erweitert den Anwendungsbereich eines Hygienekontrollprogramms, da auch Bakterien, die sich erst vermehren, wenn sie mit Lebensmitteln oder potenziellen Wirten in Kontakt kommen, mit der Impedanz-Durchflusszytometrie erfasst werden können. Außerdem können sofort Maßnahmen ergriffen werden, wenn die Reinigung und Desinfektion nicht nach Plan verläuft. 

This article was published in Spot On #15

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