Mykotoxin-Risikobewertung: Die ganze Geschichte

Die Forschungsergebnisse sind eindeutig: Lebens- und Futtermittelhersteller müssen die synergistischen Effekte eines multiplen Mykotoxin-Vorkommens berücksichtigen. Doch wie können wir erreichen, dass eine Probe all ihre Geheimnisse preisgibt? Das LC/MS-MS-Verfahren zur Bestimmung mehrerer Mykotoxine hat sich bereits als vielversprechend erwiesen.

Es existieren etwa 400 Verbindungen mit niedrigem Molekulargewicht, die als Mykotoxine eingestuft werden und jeweils eigene spezifische, toxische Wirkungen auf Mensch und Tier haben. Nationale und internationale Vorschriften und Empfehlungen decken jedoch in der Regel nur einen kleinen Teil der Mykotoxine ab: Aflatoxine B1, B2, G1, G2 und M1; Fumonisine B1, B2 und B3; Ochratoxin A, Deoxynivalenol, Zearalenon, HT-2-Toxin und T-2-Toxin. Diese Mykotoxine sind gut erforscht und werden in der verfügbaren Forschungsliteratur häufig behandelt.
Was ist jedoch über die anderen, nicht regulierten Mykotoxine in einer konkreten Probe bekannt? Welche verborgenen Risiken sind mit dem gemeinsamen Vorkommen dieser Mykotoxine verbunden? Wie finden wir heraus, was in einer Probe wirklich steckt? In diesem Artikel wird näher auf die nicht regulierten Mykotoxine eingegangen. Außerdem werden die Auswirkungen des multiplen Mykotoxin-Vorkommens diskutiert und ein Verfahren zur Analyse von Getreide- und Futterproben auf das gleichzeitige Vorhandensein mehrerer Mykotoxine vorgestellt.

Neuartige und maskierte Mykotoxine

Neuartige Mykotoxine sind jene, die aufgrund ihrer zunehmenden Häufigkeit und ihrer toxikologischen Eigenschaften (d. h. ihres Risikopotenzials für Tiere oder Menschen, die mit diesen Mykotoxinen verunreinigte Futter- bzw. Lebensmittel konsumieren könnten) potenzielle Kandidaten für eine Reglementierung sind. Strategien zur Messung und Kontrolle dieser Mykotoxine sind im Entstehen und unterliegen derzeit einer rasanten Entwicklung.
Eine besondere Unterklasse der nicht regulierten Mykotoxine sind die sogenannten „maskierten Mykotoxine“. Während der Infektion geben Pilze eine Vielzahl von Stoffwechselprodukten in die Pflanze ab, darunter die gut bekannten Mykotoxine Deoxynivalenol (DON) und Zearalenon (ZON). Häufig werden die aus dem Pilz stammenden Verbindungen dann von der Wirtspflanze weiter modifiziert. Diese chemische Modifikation stellt die „Maske“ dar, durch die die wahre Identität des Mykotoxins verdeckt wird.
Für die Wirtspflanze erfüllt die Maskierung jedoch einen wichtigen Zweck, da sie eine ihrer wirkungsvollsten Entgiftungsstrategien darstellt. In der Regel ist ein Glukosemolekül oder ein Sulfat an der Konjugation und Entgiftung beteiligt. Obwohl die maskierten Mykotoxine die Pflanze nicht weiter schädigen, kann ihre Toxizität für Mensch und Tier erneut zum Problem werden, wenn das maskierte Molekül während der Verdauung im Gastrointestinaltrakt von Säugetieren abgespalten wird (Abbildung 1). Das immer häufigere Auftreten und die zunehmende Produktion bestimmter maskierter Mykotoxine, die in der Pflanzenzüchtung beobachtet werden, könnten mit der Entstehung neuartiger, resistenter Arten in Zusammenhang stehen. Deoxynivalenol(DON)-3-Glucosid zum Beispiel wurde Berichten zufolge mit einer Resistenz gegenüber durch Fusarien verursachten Kopfbrand in Verbindung gebracht. Obwohl Fusarium-resistente Pflanzen niedrigere DON-Gesamtkonzentrationen aufweisen, wurde in diesen Pflanzen ein höheres DON-3-Glu/DONVerhältnis gemessen, was auf eine erhöhte Produktion des maskierten Mykotoxins hinweist.

Toxizität modifizierter Mykotoxine

„Modifiziertes Mykotoxin“ ist ein weiterer Begriff, der die Veränderungen beschreibt, denen Mykotoxine ausgesetzt sein können. Der Begriff „modifizierte Mykotoxine“ bezieht sich sowohl auf die Modifikation eines Ausgangstoxins durch den Pilz selbst als auch auf die Maskierung des Toxins im Pflanzengewebe. Eine weitere Art der Modifikation findet bei Säugetieren statt, wenn Aflatoxin B1 über verunreinigtes Futter verzehrt und in Aflatoxin M1 umgewandelt wird. Dieses Aflatoxin M1 gelangt in die Milch laktierender Tiere, über die es anschließend ausgeschieden wird. Darüber hinaus können Toxine auch während der Lebensmittelverarbeitung, insbesondere beim Erhitzen und Fermentieren, modifiziert werden, wodurch ihre Prävalenz steigt. Die so modifizierten Mykotoxine können in gesundheitsrelevanten Mengen in Lebensund Futtermitteln enthalten sein.
Von allen Mykotoxinen ist Deoxynivalenol im Hinblick auf häufig beobachtete Modifikationen am besten erforscht. Die modifizierten Formen von Deoxynivalenol lassen sich in zwei Hauptgruppen einteilen: chemisch veränderte und maskierte Formen. Es gibt zwei Hauptformen von chemisch verändertem Deoxynivalenol, die der Pilz selbst ausscheidet: 3-Acetyl-Deoxynivalenol und 15-Acetyl-Deoxynivalenol, wie sie in Fusarium-kontaminierten Getreidearten vorkommen. Pflanzen sind in der Lage, Deoxynivalenol zu Deoxynivalenol-3-Glucosid umzuwandeln und so zu maskieren. Wie aktuelle Studien zeigen, kann DON-3-Glucosid zwei sulfonierte Formen annehmen: Deoxynivalenol-3-Sulfat und Deoxynivalenol-15-Sulfat.
Welche spezifischen Schäden können modifizierte, maskierte und andere neuartige Mykotoxine verursachen? Modifizierte Mykotoxine können entweder toxischer oder weniger toxisch sein als ihre Ausgangsverbindungen. So können sie beispielsweise aufgrund von Modifikationen eine höhere Bioverfügbarkeit aufweisen. Die toxikologischen Daten zu modifizierten Mykotoxinen sind begrenzt und die aktuellen Forschungsergebnisse und Erkenntnisse über die tatsächlichen Risiken und Auswirkungen dieser Verbindungen sind unzureichend. Dieses Wissensdefizit erschwert die Durchführung einer fundierten Risikobewertung. Gleichwohl liegen Studien vor, in denen das potenzielle Risiko, das modifizierte Mykotoxine für die Lebensmittelsicherheit darstellen, beschrieben wird. Maskierte Mykotoxine können im Verdauungstrakt von Mensch und Tier „demaskiert“ werden. Dabei wird die Ausgangsverbindung freigesetzt und kann ihre toxikologische Wirkung erneut entfalten. Ähnlich verhält es sich mit anderen neuartigen Mykotoxinen: Es liegen nur begrenzte toxikologische Daten vor, was die Festlegung von Vorschriften und Grenzwerten für maximal tolerierte Dosen (MTD) zum Schutz von Mensch und Tier vor möglichen Gesundheitsrisiken erschwert.
Da sich modifizierte Mykotoxine hinsichtlich ihrer chemischen Reaktionen anders verhalten als die jeweiligen Ausgangsmykotoxine, können sie im Rahmen der Routineanalyse leicht übersehen werden. Die derzeitigen Nachweismethoden für regulierte Mykotoxine in Lebens- und Futtermitteln beinhalten kein routinemäßiges Screening auf diese modifizierten Mykotoxine, da diese nicht unter die gesetzlichen Vorschriften fallen. Eine Untersuchung mithilfe der Standardmethoden ergibt möglicherweise Kontaminationswerte unterhalb der gesetzlichen Grenzwerte, während Kontaminationen durch modifizierte Mykotoxine unentdeckt bleiben. Dieses Ergebnis ist zwar korrekt, aus toxikologischer Sicht würde die Integration von modifizierten Toxinen (z. B.als Summenparameter) jedoch zuverlässigere Daten für die Risikobewertung liefern. Zusammengenommen weisen alle diese Fakten auf die potenziellen Gefahren für die menschliche Gesundheit hin, die von modifizierten Mykotoxinen ausgehen. Verordnungen über Höchstgehalte für modifizierte Mykotoxine sowie für andere neuartige Mykotoxine sind derzeit Gegenstand von Diskussionen in der Europäischen Behörde für Lebensmittelsicherheit.

Multiples Mykotoxinvorkommen

Da wir nun wissen, dass mehrere Mykotoxine von ein und demselben Pilz produziert werden, ist es nicht verwunderlich, dass die synergistische Wirkung eines multiplen Mykotoxinvorkommens zunehmend Gegenstand der Forschung geworden ist. Die in den letzten Jahren im Rahmen mehrerer unabhängiger Studien gesammelten Daten zeigen, dass landwirtschaftliche Rohstoffe oft mit mehr als einem Mykotoxin kontaminiert sind. Die toxikologischen Wechselwirkungen von Mykotoxinen sind in der Regel synergistisch. Das bedeutet, dass die toxikologische Wirkung von zwei oder mehr in derselben Probe vorhandenen Mykotoxinen höher ist, als die Summe der toxikologischen Wirkung der einzelnen Mykotoxine. Allerdings kann das gemeinsame Auftreten mehrerer Mykotoxine auch additive oder, seltener, antagonistische Effekte haben, durch die sich die Mykotoxinwirkungen gegenseitig aufheben.

Diese synergistischen Effekte sind von Tier zu Tier unterschiedlich und können sehr komplex sein. In Abbildung 2 sind sowohl die synergistischen, als auch die additiven Effekte bestimmter Mykotoxine bei Geflügel dargestellt. So ist zum Beispiel Aflatoxin B1 (AFB1) ein reguliertes Mykotoxin, das synergistische Effekte mit Diacetoxyscirpenol (DAS) und Cyclopiazonsäure (CPA), beides nicht regulierte Mykotoxine, und eine additive Wirkung mit DON, einem weiteren regulierten Mykotoxin, zeigt.

Beim Schwein hat das gemeinsame Vorkommen von AFB1 und DON oder DAS dagegen keine bekannten Auswirkungen, wie in Abbildung 3 dargestellt. Stattdessen zeigt AFB1 bei dieser Tierart synergistische Effekte mit T-2-Toxin und Ochratoxin.

Im Folgenden wird auf die Vorteile, Grenzen und die Entwicklung der Methode unter Berücksichtigung der chemischen Vielfalt der Analyten und der Bandbreite der zu testenden landwirtschaftlichen Rohstoffe eingegangen.

Multi-Mykotoxin-Analyse

Analytiker setzen zunehmend auf LC-MS/ MS (Flüssigkeitschromatographie/Tandem- Massenspektrometrie) als wichtigste Methode zum Nachweis mehrerer Mykotoxine. Analysemethoden auf Basis der LC-MS/MS haben sich in den letzten zehn Jahren zu einer leistungsstarken und hochmodernen Messtechnik für die qualitative und quantitative Analyse von Mykotoxinen entwickelt. Dieses Verfahren ermöglicht die gleichzeitige Bestimmung eines breiten Spektrums von Mykotoxinen verschiedener chemischer Familien mit einer einzigen Messung: Saure (Fumonisine), basische (Mutterkornalkaloide), polare (Moniliformin, Nivalenol) und apolare Verbindungen (Zearalenon, Beauvericin) können alle gleichzeitig mit LC-MS/MS quantifiziert werden.
Weitere Vorteile dieser Methode sind ihre hohe Empfindlichkeit und Selektivität sowie die Möglichkeit, zusätzliche Informationen über das Masse/Ladungs-Verhältnis (m/z) und die Fragment- Ionen der untersuchten Analyten zu erhalten.
Die Etablierung einer Multi-Mykotoxin-Methode auf Basis der LC-MS/MS erfolgt in der Regel in drei Phasen: Methodenentwicklung, Methodenoptimierung und Methodenvalidierung. Diese Schritte und Parameter sind in Abbildung 4 zusammengefasst. Während der Methodenentwicklung und -optimierung sollten die Qualität und Zuverlässigkeit der Ergebnisse sorgfältig geprüft werden. Zu diesem Zweck müssen Analysestandards von höchster Qualität mit zertifizierter Konzentration und ausgewiesener Reinheit verwendet werden. Für bestimmte Analyten sind analytische Standards jedoch nicht kommerziell erhältlich. In diesen Fällen kann unter Umständen auf Standards, die sich noch in der Entwicklungsphase befinden, zurückgegriffen werden. Alternativ kann mit verfügbarem, aber weniger gut charakterisiertem Material gearbeitet werden.

Methodenentwicklung

Bei der Entwicklung einer Methode auf Basis der LC-MS/MS müssen die MS- und LC-Parameter sowie die Probenvorbereitung optimiert werden. Um die MS-Parameter zu optimieren, sollte jede Zielverbindung als reiner Analysestandard direkt in das Massenspektrometer injiziert werden. Dies ermöglicht die Auswahl des besten Ionisationsmodus (positiv oder negativ) und der am häufigsten vorkommenden Vorläufer- und Produkt-Ionen.
Außerdem können in dieser Phase die chromatographischen Bedingungen angepasst werden: Die geeigneten mobilen Phasen und Gradienten sowie die optimale chromatographische Säule müssen ausgewählt werden.
Viele Multi-Mykotoxin-Methoden verwenden einen „Verdünnen-und-Injizieren-Ansatz“: Dies bezieht sich auf die gängige Praxis, den Probenextrakt zu verdünnen, bevor er in das LC-MS/MS injiziert wird. Im Rahmen der Probenvorbereitung kann auch ein Reinigungsschritt durchgeführt werden. Das Mykotoxinmuster darf jedoch während der Probenreinigung nicht verändert werden, d. h. es muss sichergestellt sein, dass keins der gesuchten Mykotoxine von der für die Aufreinigung verwendeten Methode beeinflusst wird.

Methodenoptimierung

Zur Optimierung der Analysemethode gehören die Stabilitätsprüfung der Analyten in Standardlösungen und Proben sowie der Nachweis der Selektivität und die Bestimmung des Arbeitsbereichs.

Methodenvalidierung

Die Methodenvalidierung ist Voraussetzung für verlässliche Ergebnisse in Bezug auf Vergleichbarkeit und Rückverfolgbarkeit. Die Methodenvalidierung muss für jeden Zielanalyten in allen erforderlichen Matrizen separat durchgeführt werden. Typische Leistungsmerkmale, die bei der Validierung einer quantitativen Methode bewertet werden sollten, sind Nachweisgrenzen (limit of detection — LOD), Quantifizierungsgrenzen (limit of quantitation — LOQ), Linearität, Präzision, Selektivität, Robustheit, Genauigkeit, Matrixeffekte und Wiederfindungen. Die validierten Matrizen für von Romer Labs eingesetzte Multi-Mycotoxin Analysis 50+ sind Weizen, Mais, Schweinefutter und Silage.
Matrix-Effekte treten auf, wenn der Ionisationsprozess der Zielanalyten durch Matrixkomponenten beeinträchtigt wird. Matrixeffekte können einen erheblichen Einfluss auf die Quantifizierung von Mykotoxinen haben. Daher ist es unbedingt erforderlich, die Matrixeffekte zu bestimmen und auszugleichen. Erreicht werden kann dies durch die Bestimmung der Wiederfindungsraten, gefolgt von einer mathematischen Korrektur der Ergebnisse um diesem Wert. Auch durch eine matrixangepasste Kalibrierung oder durch die Verwendung von isotopenmarkierter interner Standards können Matrixeffekte ausgeglichen werden. Letzteres führt zu äußerst präzisen und zuverlässigen Ergebnissen bei gleichzeitig minimalem Zeitund Kostenaufwand pro Probe. Das Verfahren kann durch dotierte Konzentrationsreihen des Analyten in Mehrfachmessung validiert werden. Wenn verfügbar, sollten die Ergebnisse mit zertifizierten Referenzmaterialien bestätigt werden. Darüber hinaus ermöglichen matrixangepasste Referenzmaterialien und die Teilnahme an Laborvergleichsuntersuchungen eine zusätzliche Qualitätssicherung.

Fazit

Die Entwicklung von Multi-Mykotoxin-Methode auf Basis der LC-MS/MS zeigen großes Potenzial, das Risiko von multiplen Mykotoxin-Vorkommen frühzeitig zu erkennen. Je mehr wissenschaftliche Erkenntnisse zu den synergistischen Effekten verschiedener Mykotoxine, einschließlich neuartiger und maskierter Mykotoxine, zur Verfügung stehen, desto wichtiger werden validierte Analysemethoden, die diese Mykotoxine innerhalb einer einzigen Probe nachweisen können.

Eine Vielzahl verschiedener Parameter, die die Qualität und Zuverlässigkeit der Ergebnisse der LC-MS/ MS-Methode maßgeblich beeinflussen, muss für die jeweiligen Analyten in einer gegeben Matrix jeweils separat berücksichtigt werden. Darüber hinaus sind angesichts der chemischen Vielfalt der Mykotoxine Kompromisse bei der Methodenentwicklung erforderlich. Außerdem stellt die große Bandbreite der landwirtschaftlichen Rohstoffe sowie die unterschiedlichen Konzentrationsbereiche und Häufigkeitsverteilungen weitere Herausforderungen bei der Methodenentwicklung und -optimierung dar. Nichtsdestotrotz werden neue Multi-Mykotoxin- Methoden dringend benötigt und es ist davon auszugehen, dass die technologischen Fortschritte in diesem Bereich die Anwendung dieser Verfahren weiter forcieren werden.

Dieser Artikel wurde in unserem Special Spot On Magazin veröffentlicht

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