Schnellverfahren für Oberflächen-Hygienetests: Genauer betrachtet

Sie müssen Ihre strengen Hygienestandards erfüllen, und die Einhaltung der Standards muss wiederum verifiziert werden. Stefan Widmann erläutert ausführlich die gängigsten Tests für Reinigungs- und Hygienekontrollen von Oberflächen, damit Sie das für Ihren Betrieb geeignetste Verfahren auswählen können.

Gängige Testverfahren zur Umgebungsprüfung lassen sich allgemein in zwei Gruppen einteilen, von denen jede einen anderen Ansatz verfolgt: entweder die Prüfung auf Rückstände oder die Prüfung auf Mikroorganismen. In diesem Beitrag gehen wir auf die verschiedenen Technologien der jeweiligen Ansätze ein, auf ihre Funktionsweise sowie auf ihre Anwendbarkeit und Vorteile.

Rückstandsuntersuchungen

ATP-Tests

Adenosintriphosphat (ATP) ist ein Nukleotid, das in der Zelle als Coenzym zur Bereitstellung von Energie dient. Man kann es sich als die molekulare „Währungseinheit“ für den Energietransfer innerhalb aller lebenden Zellen vorstellen. Sämtliche Vorgänge auf zellulärer Ebene, einschließlich der Synthese von Proteinen und Membranen, der Zellbewegung und der Zellteilung, benötigen Energie. Bei der Spaltung von ATP in Adenosindiphosphat und Adenosinmonophosphat wird Energie übertragen. Die Hydrolyse der kovalenten Phosphatbindungen setzt Energie frei, die für Reaktionen genutzt wird.

Kommerzielle ATP-Testsysteme nutzen die in der Natur weit verbreitete Luciferin-Luciferase-Reaktion, um mit der aus ATP freiwerdenden Energie sichtbares Licht zu erzeugen. Je mehr Licht emittiert wird, desto mehr ATP ist vorhanden, was auf einen höheren Gehalt an Lebensmittelrückständen oder Mikroorganismen hinweist. Dabei darf ein wichtiger Punkt nicht übersehen werden: Da diese Systeme häufig zur Validierung der Reinigungseffizienz eingesetzt werden, sind auch Desinfektionsmittel häufig an der Reaktion beteiligt. Diese Desinfektionsmittel können zwar die Zellwände der Mikroorganismen schädigen, die ATP in den Zellen bleibt jedoch erhalten. Aus diesem Grund besteht nicht immer eine reelle Korrelation zwischen den auf einer Oberfläche vorhandenen lebenden Organismen und den Ergebnissen der ATP-Messung.

ATP-Methoden haben noch einen weiteren potenziellen Nachteil: Je nachdem, welche Lebensmittelrückstände nachgewiesen werden sollen, bestehen Unterschiede im Hinblick auf ihre Anwendbarkeit. So eignet sich beispielsweise ein ATP-Test nicht für den Nachweis von Weizenmehl, einer Matrix mit hohem Verarbeitungsgrad, deren Rückstände nur wenig ATP enthalten. Rückstände von Fleischprodukten enthalten jedoch hohe Mengen an ATP.

Verfahren zum Nachweis von Gesamtprotein

Ein weiteres Konzept in der Rückstandsuntersuchung ist der Nachweis von Gesamtprotein, wobei nicht die Mikroorganismen selbst, sondern Aminosäuren, Peptide und Proteine nachgewiesen werden. Diese Tests sind sehr schnell durchführbar und das Ergebnis liegt innerhalb von einer Minute vor. Allerdings ist die Methode nicht empfindlich genug, um Proteine von einzelligen Mikroorganismen nachzuweisen. Aus diesem Grund lässt ein negatives Ergebnis bei dieser Art von Test nicht auf die Abwesenheit von Mikroorganismen schließen. Darüber hinaus eignet sich die Methode nicht dazu, bestimmte Pathogene nachzuweisen. Dennoch haben Testkits für den Proteinnachweis ihre Berechtigung, da sie auf schnelle und kostengünstige Weise Aufschlüsse über die Reinigungseffizienz geben.

Nachweis von Mikroorganismen

Kulturmethoden mit chromogenen Medien

Dies sind die klassischen Methoden für das Hygienemonitoring in Verarbeitungsbereichen. Kulturmethoden werden in der ISO 18593 „Mikrobiologie der Lebensmittelkette — Horizontales Verfahren für Probenahmetechniken von Oberflächen“ behandelt. Nicht-selektive und selektive Medien können zum Nachweis spezifischer Organismen verwendet werden.

Methoden, die auf chromogenem Agar basieren

Grundsätzlich gibt es zwei Möglichkeiten, agarbasierte Methoden durchzuführen; entweder direkt oder indirekt über einen Verdünnungsschritt. Beide Methoden haben den Vorteil, dass sie quantitative Ergebnisse liefern.

Bei direkten Verfahren wird der Agar von Platten oder Dip-Slides direkt auf die zu untersuchende Oberfläche gedrückt. Kontaktplatten haben die Form von klassischen Petrischalen und typischerweise eine Oberfläche von 25 cm2. Dip-Slides sind doppelseitige Agarträger, die durch ein Kunststoffröhrchen geschützt sind und eine Agarfläche von 7-10 cm2 auf jeder Sei-te des Trägers aufweisen, was einer Gesamtfläche von 14-20 cm2 entspricht. Diese Systeme benötigen keine zusätzliche Ausrüstung und die Probenahme ist sehr schnell durchgeführt. Allerdings eignet sich diese Me-thode nicht für alle Probeflächen.

Tupfer, Tücher und Schwämme sind Hilfsmittel für die indirekte Probenahme. Nachdem ein Abstrich der zu prüfenden Oberfläche mittels Probenahmetools genommen wird, werden diese zur Verdünnung in eine Pufferlösung eingetaucht, die dann in herkömmlichen Petrischalen ausplattiert wird. Mithilfe dieser indirekten Methode können sowohl größere Oberflächen als auch schwer zugängliche, engen Stellen und Ritzen beprobt werden. Indirekte Methoden haben jedoch auch Nachteile: Es sind mehr Arbeitsschritte erforderlich und es werden zusätzliche Verbrauchsmaterialien benötigt. Für den Pathogennachweis wird in der ISO-Norm die Beprobung einer Fläche von 1000 cm2 bis 3000 cm2 empfohlen; eine so große Fläche kann nur mit Schwämmen oder Tupfern bzw. Tüchern beprobt werden.

Nachweismethoden auf der Basis chromogener Flüssigmedien

Diese Kulturmethode wird nur für den qualitativen Nachweis bestimmter Organismen oder Organismengruppen eingesetzt. Sie liefert keine quantitativen Ergebnisse, da die Mikroorganismen nicht gezählt werden. Bei Verfahren, die auf Flüssigmedien basieren, werden die zur Probenahme verwendeten Tupfer an-schließend in Röhrchen getaucht, die mit Selektivmedien gefüllt sind. Die Proben müssen durchschnittlich mindestens 48 Stunden lang inkubiert werden, um ein negatives Ergebnis sicher zu bestätigen. Positive Proben können anhand der Farbänderung oder Fluoreszenz der angereicherten Probe bei einer bestimmten Wellenlänge identifiziert werden. Diese Tests sind in der Regel einfach durchzuführen und kostengünstig.

Der Nachteil von Systemen auf der Basis von Flüssigmedien ist ihre geringe Empfindlichkeit. Diese resultiert aus der Verwendung hochselektiver Medien, die das Wachstum anderer Bakterien gezielt unterdrücken. Bei dieser Methode besteht ein gewisses Risiko: Bakterien in der Verarbeitungsumgebung sind in der Regel bereits gestresst (geschädigt) und können absterben, wenn die Anreicherungsmedien zu selektiv sind. Andererseits kann es bei zu geringer Selektivität schwierig sein, bestimmte Mikroorganismen allein mithilfe selektiver Flüssigmedien nachzuweisen. Die Interpretation der Ergebnisse kann sich als schwierig erweisen und je nach Untersucher unterschiedliche Resultate liefern, da die Farbänderung bzw. die Fluoreszenz nicht immer kräftig genug ist, um ein eindeutiges Ergebnis erkennen zu lassen. Der Hauptvorteil von Methoden auf Basis von Flüssigmedien besteht darin, dass sie einfach durchzuführen und erschwinglich sind.

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DNA-basierte Methode

Es gibt drei verschiedene DNA-basierte Methoden: die isothermale DNA-Amplifikation, Echtzeit- und traditionelle PCR. Bei der Echtzeit-PCR oder Realtime PCR handelt es sich um eine etablierte Methode zum Nachweis von DNA oder RNA, während die isothermale Amplifikation eine neuere Technologie ist. Die isothermale Amplifikation hat gegenüber der Realtime-PCR klare Vorteile: So wird für die isothermale Amplifikation kein Thermocycler benötigt, da die Reaktion bei konstanter Temperatur stattfindet. Die kostengünstigste, aber auch arbeitsintensivste DNA-basierte Methode ist die traditionelle PCR, da für den Nachweis amplifizierter DNA oder RNA nach der Amplifikation ein Hybridisierungsschritt oder die Verwendung eines unspezifischen Farbstoffs notwendig ist.

Allen Verfahren ist gemeinsam, dass bestimmte Teile der DNA oder RNA von spezifischen Primern erkannt und anschließend mithilfe des Enzyms Polymerase vervielfältigt werden. Die Empfindlichkeit dieser Methoden ist ausgesprochen hoch, und die Zielregionen in der DNA oder RNA sind hinreichend bekannt um größtmögliche Spezifiziät zu gewährleisten. Die größte Einschränkung dieses Systems ist, dass es auf Enzymbasis funktioniert. Enzyme benötigen spezifische Pufferlösungen, um einwandfrei zu funktionieren. Inhaltsstoffe von Desinfektionsmitteln können die Enzymaktivität stark beeinträchtigen, was zu falsch negativen Ergebnissen führen kann. Darüber hinaus sind bei diesem Verfahren mehrere Pipettierschritte unter Verwendung einer Mikropipette erforderlich, was eine Fehlerquelle darstellen kann.

Der größte Vorteil DNA-basierter Methoden besteht darin, dass aufgrund der hohen Sensitivität des Verfahrens nicht-selektive Medien für den Anreicherungsschritt verwendet werden können. Nicht-selektive Medien sind kostengünstig, bei verschiedenen Anbietern erhältlich und erfordern die niedrigste biologische Schutzstufe (Stufe 1). Mithilfe DNA-basierter Metho-den ist es zudem möglich, geringe Mengen von Patho-genen auf Oberflächen der Lebensmittelumgebung auch ohne Anreicherung nachzuweisen. Allerdings ist die Empfindlichkeit im Vergleich zu Methoden mit Anreicherung gering. Abschließend sei darauf hingewiesen, dass falsch positive Ergebnisse aufgrund von DNA-Fragmenten bereits abgetöteter Pathogene ein großes Problem darstellen können.

Immunologische Verfahren

Immunoassays sind Testsysteme, bei denen Antikörper zum Nachweis von Mikroorganismen in Lösungen verwendet werden. Diese Antikörper können an Antigene, z. B. Lipopolysaccharide auf der Zelloberfläche oder Geißeln bestimmter Mikroorganismen, binden. Nach einem ein- oder mehrstufigen Anreicherungsverfahren unter Verwendung selektiver Medien werden Zellen von Pathogenen wie beispielsweise Listerien mithilfe spezifischer antikörperbasierter Testsysteme nachgewiesen.

ELISA-Tests (enzyme-linked immunosorbent assay) waren die ersten Verfahren, bei denen spezifische Mikroorganismen mithilfe immunologischer Techno-logien nachgewiesen wurden. Der ELISA ermöglicht die Quantifizierung des nachgewiesenen Analyten. Da jedoch ein Anreicherungsschritt erforderlich ist, ist die Berechnung der Anfangskonzentration nicht mög-lich. Nur geschultes Personal kann die bei der Durch-führung von ELISA-Tests erforderlichen mehrfachen Transfer- und Waschschritte durchführen. Die Entwicklung von Lateral-Flow-Tests, auch Streifen-Tests genannt, brachte die Lösung für dieses Problem: Das immunologische Nachweisverfahren wurde wesentlich vereinfacht und verkürzt und die zahlreichen Arbeitsschritte der ELISA-Tests entfielen. Lateral-Flow-Tests mit selektiven Antikörpern, die in Kombination mit leistungsstarken Anreicherungsmedien verwendet wer-den, liefern schnelle und genaue Ergebnisse, ohne dass teure Geräte oder Schulungskosten erforderlich sind.

Schlussfolgerung

Die Wahl der richtigen Verfahren für Hygienetests ist nicht immer einfach. Die Entscheidung wird durch mehrere praktische Überlegungen beeinflusst: Wie viele Probestellen müssen beprobt werden und wie wichtig ist ein hoher Testdurchsatz? Wie können die Prüfer die Zeit bis zum Ergebnis optimieren, zumal die Untersuchung auf bestimmte pathogene Bakterien nicht jeden Tag durchgeführt wird und eher eine Überwachungsfunktion darstellt als ein Verfahren zur Qualitätskontrolle? Sind quantitative Ergebnisse erforderlich oder sind Anwesenheits-/Abwesenheits-Tests ausreichend? Da es nach wie vor nicht möglich ist, Keimzahlen unmittelbar nach der Reinigung zu bestimmen, müssen sich die Hersteller auf ATP- oder proteinbasierte Testsysteme verlassen. Diese dienen als grober Indikator dafür, ob es sicher ist, mit der Produktion zu beginnen, je nachdem, ob ATP oder Protein vorhanden ist oder nicht.

Auch nationale Bestimmungen können diese Ent-scheidung beeinflussen. Anreicherungsbasierte DNA- oder immunologische Methoden sind anderen Verfahren in Bezug auf Sensitivität und Selektivität überlegen und für den Pathogennachweis am besten geeignet. Für den Nachweis und die Zählung von Indikatororganismen oder das generelle Hygienemonitoring können kostengünstigere Systeme wie Dip-Slides oder ATP-Systeme verwendet werden. 

Dieser Artikel wurde in unserem Spot On #8 Magazin veröffentlicht.

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