Creación de calibradores líquidos de micotoxinas: Una mirada entre bastidores

Los materiales de referencia, o calibrantes, describen sustancias u objetos con uno o más valores de propiedades características definidas que se utilizan como medida o como punto de referencia para los métodos de medición. Dada la importancia de la seguridad del consumidor para la industria alimentaria y de piensos, las pruebas de micotoxinas implican el uso de materiales de referencia para obtener resultados precisos y fiables.

Un peligro siempre presente

Las micotoxinas son metabolitos fúngicos secundarios de origen natural tóxicos para los animales y los seres humanos. Los hongos del moho crecen en el campo y durante el almacenamiento. Presentes en casi todas las materias primas agrícolas del mundo, se han identificado más de 380 micotoxinas y la toxicidad de cada sustancia varía enormemente. Las concentraciones máximas predeterminadas permitidas de diversas micotoxinas en materias primas vegetales como el grano, el trigo o el maíz -por nombrar sólo algunas- han obligado a los productores de materias primas a examinar cuidadosamente sus muestras en un laboratorio analítico para estar seguros de la calidad de sus productos.

Preparación gravimétrica

Con frecuencia, un hongo que crece en condiciones óptimas -temperaturas suficientemente cálidas, humedad elevada y un sustrato adecuado- puede producir micotoxinas. En el laboratorio, la historia de un material de referencia comienza con el intento de ajustar las condiciones de crecimiento artificial para obtener rendimientos óptimos de micotoxinas. Esto incluye el uso de un género fúngico adecuado -ya que cada hongo produce su propio patrón característico de metabolitos que pueden ascender a varios cientos. El mantenimiento de las cepas fúngicas para la producción es crucial. Su vitalidad y funcionalidad se vigilan constantemente, ya que esto constituye la base de todas las actividades para los procesos de producción de material de referencia. Los mohos son organismos vivos que pueden mutar con el tiempo, o incluso degenerar y dar lugar a una disminución de los rendimientos de micotoxinas. Pueden formarse nuevos metabolitos tras un cierto periodo de almacenamiento, lo que también puede influir enormemente en el proceso de aislamiento. Las cepas deben renovarse regularmente para contrarrestar mutaciones, impurezas u otras características indeseables.

El primer paso, la fermentación, depende de que el entorno del laboratorio sea literalmente lo más apetitoso posible para el hongo con el fin de promover su crecimiento. Los medios óptimos también varían de una cepa a otra, por lo que se aportan componentes como sales y minerales como fuente de nutrientes. Se deja que el moho crezca durante un tiempo determinado -de unos días a unas semanas-, durante el cual el hongo metaboliza su medio.

Una vez finalizada la fermentación y tras un cuidadoso control del proceso, la micotoxina se extrae del material de cultivo utilizando un disolvente orgánico adecuado. Dependiendo de la estructura molecular, puede tratarse de disolventes orgánicos polares o no polares. Durante la fermentación, los mohos suelen producir impurezas además de la toxina de interés, por ejemplo, otros metabolitos, colorantes, aceites, etc.

El extracto crudo resultante suele contener muchas impurezas. Durante el aislamiento o la purificación, la micotoxina se acerca paso a paso a la pureza objetivo de >98% mediante diversas aplicaciones cromatográficas y preparativas con diferente selectividad. Algunas toxinas tienen estructuras moleculares favorables y pueden cristalizarse a partir de una solución sobresaturada de disolventes orgánicos polares o apolares. Esto ocurre, por ejemplo, enfriando la solución, evaporando el disolvente de cristalización o mezclando varios disolventes de distinta polaridad. Otras toxinas pueden convertirse en forma cristalina, en polvo, mediante liofilización. Mediante la cristalización se aumenta de nuevo la pureza de la toxina hasta obtener la pureza objetivo.

Control de calidad

La HPLC, el fotómetro UV y la HPLC-MS se utilizan para determinar/confirmar la pureza de la materia prima producida. Dependiendo de la toxina, esto puede hacerse, por ejemplo, mediante cromatografía líquida de alta resolución en combinación con detección por matriz de diodos, detección por fluorescencia o similar, con fotómetro UV (análisis cualitativo y cuantitativo del compuesto) o mediante cromatografía líquida de alta resolución combinada con detección por espectrometría de masas. La EM es especialmente necesaria para la determinación descrita de la pureza isotópica (por ejemplo, > 98% de átomos de 13C) de las micotoxinas marcadas con isótopos de 13C. Los materiales de referencia de micotoxinas ocupan un nicho en el mercado. Por lo tanto, a veces es difícil encontrar sustancias de comparación que estén disponibles comercialmente y puedan utilizarse para el control de procesos durante la producción y los controles de calidad.

Entrega

Tras pasar el control de calidad final, la micotoxina sólida se licua para su uso como material de referencia líquido de micotoxinas. A continuación, la solución de calibrante líquido se embotella y se crea un certificado de análisis, en el que se indica el valor de la propiedad y su incertidumbre, que acompaña a cada uno de los calibrantes.