Prevención de falsos positivos en las pruebas de patógenos

Costosos y tediosos de seguir, los resultados falsos positivos en la detección de patógenos pueden minimizarse con fagos que reduzcan la aparición de bacterias de reacción cruzada en las pruebas de patógenos. Las bacterias de reacción cruzada pueden causar resultados falsos positivos e inhibir el crecimiento del patógeno en cuestión.

Los falsos positivos ocasionan costes adicionales a los productores de alimentos, además del tiempo extra necesario para confirmar los resultados. Según las normas ISO/FDA/USDA, el proceso de confirmación de los resultados de las pruebas comienza con el rayado de placas de agar selectivas a partir de la muestra presuntamente positiva. Estas placas de agar deben incubarse durante dos días para comprobar si se trata de una muestra con un resultado positivo real, e incubarse a una temperatura diferente a la de las muestras de rutina. Si un laboratorio no dispone de una incubadora adicional, la incubadora principal debe apartarse y ajustarse a la temperatura requerida, lo que supone un tiempo de inactividad, ya que la incubadora no puede utilizarse para los enriquecimientos. Otro aspecto negativo del paso de confirmación es que las placas de agar selectivo cuestan dinero. Como tienen una vida útil muy limitada, es difícil mantenerlas en stock. En general, las pruebas de falsos positivos exigen tiempo y dinero innecesarios.

El problema de los falsos positivos

Los falsos positivos pueden producirse con cualquier método de detección de patógenos. No importa si se trata de una tecnología basada en el ADN, bioquímica o inmunológica. Todas se enfrentan al mismo problema de mayor sensibilidad frente a mayor selectividad. Un buen enfoque consiste en eliminar las bacterias de reacción cruzada antes de la detección, y para ello se utilizan los antibióticos. Pero para la mayoría de las aplicaciones, los antibióticos carecen de selectividad.

Superar el reto de la selectividad

Los bacteriófagos (o fagos) son los organismos más abundantes en nuestro entorno y están presentes en grandes cantidades en el agua, los alimentos y otras fuentes diversas. Fueron descubiertos por el biólogo canadiense Félix Hubert d'Hérelle en 1917. Su nombre significa "comedores de bacterias", lo que define en cierto modo lo que hacen. Los bacteriófagos tienen una gran especificidad de huésped, adhiriéndose a las bacterias. La gran ventaja de utilizar fagos es que son inofensivos para los seres humanos, los animales y las plantas. De hecho, los humanos están expuestos de forma rutinaria a los fagos a través del consumo de alimentos o agua sin efectos negativos. Los fagos pueden denominarse "los enemigos naturales" de las bacterias de las que son específicos. En la carne procesada y los productos cárnicos, hay unos 108 fagos por gramo. También hay un elevado número de fagos en el tracto gastrointestinal humano. Antes de que los antibióticos estuvieran ampliamente disponibles, los fagos se utilizaban para tratar las infecciones bacterianas.

Utilizados durante décadas

La llamada terapia con fagos se desarrolló en EE.UU. y en la antigua URSS. Incluso mientras se desarrollaban antibióticos en el mundo occidental, el antiguo bloque soviético continuó sus investigaciones sobre la terapia con fagos. En la época posterior a la guerra fría, las actividades de investigación sobre los fagos continuaron en Georgia, donde se siguen llevando a cabo en la actualidad. Los fagos tienen una especificidad muy alta respecto a sus bacterias huésped, una característica que presenta aplicaciones potencialmente interesantes para la alimentación humana y animal, así como para la industria biotecnológica. Hoy en día, los fagos se utilizan como aditivos para eliminar organismos patógenos en los alimentos, como instrumento para detectar bacterias, o como suplemento en el sistema de medios SELECT™ de los laboratorios Romer, para reducir o incluso eliminar la flora bacteriana competitiva, permitiendo que las especies de bacterias patógenas objetivo crezcan hasta un nivel detectable. Son más selectivos que los antibióticos y los microbios no desarrollan ninguna resistencia a ellos.

Identificación de bacterias con reactividad cruzada

Para identificar los fagos, que pueden utilizarse en medios de enriquecimiento selectivo u otras aplicaciones para inhibir o incluso eliminar bacterias competitivas, la pregunta clave es: ¿Cómo puedo empezar siquiera a encontrarlos? La mejor forma de empezar es examinando muestras de alimentos o piensos, porque estos materiales de prueba contienen bacterias que deberían inhibirse durante el enriquecimiento. Las cepas de bacterias que están lejanamente relacionadas, con el patógeno buscado, no son el objetivo de los fagos, pero las cepas que están estrechamente relacionadas con el patógeno objetivo podrían causar resultados falsos positivos.

¿Transgénicos? En absoluto.

Una vez identificadas las bacterias de fondo con reacción cruzada, el siguiente paso es buscar un fago que pueda actuar contra ellas. Los fagos pueden encontrarse en todas partes, como en las aguas residuales sin depurar, las aguas superficiales, los alimentos y el entorno agrícola. La forma más fácil de extraerlos, si se trata de una matriz vendida, es la centrifugación. De este modo, los fagos permanecerán en el sobrenadante, mientras que otros componentes, como las bacterias, formarán un precipitado en el fondo del recipiente. Este sobrenadante contiene una mezcla heterogénea de diferentes fagos. A continuación se aíslan los diferentes fagos y habrá que determinar el huésped bacteriano al que infectan. Esto puede hacerse mediante la llamada "técnica del agar blando por encima o por simple moteado". En esta técnica, se superpone un césped de bacterias sobre una placa de agar tradicional y se manchan los sobrenadantes de fagos sobre el césped bacteriano. Tras una incubación de una noche, los fagos crean placas (o zonas de aclaramiento), que son visibles a simple vista. Las placas son zonas en las que los fagos han matado a las bacterias mediante una reacción lítica. Ahora, los clones de fagos pueden aislarse del agar, lo que significa que todos son copias de la misma cepa de fagos.

Cómo ayudan los fagos

Ahora es el momento de encontrar los mejores fagos para matar las bacterias de reacción cruzada en los enriquecimientos de patógenos. Esto se consigue probando los fagos contra las bacterias de reacción cruzada, así como contra el patógeno objetivo. Se prefiere un formato de microtitulación para minimizar los costes y acelerar las pruebas. Una reacción lítica visible en un pocillo indica que el fago es eficaz contra la bacteria. Tras varios ensayos de laboratorio, pueden identificarse finalmente los fagos adecuados, es decir, aquellos que inhiben el crecimiento de cepas bacterianas estrechamente relacionadas y, al mismo tiempo, no afectan al crecimiento del patógeno objetivo. Estos fagos pueden utilizarse entonces para eliminar las bacterias de reacción cruzada en los sistemas de pruebas de detección de patógenos, reduciendo la incidencia de falsos positivos en un programa de vigilancia de patógenos y ahorrando así mucho dinero y tiempo.