5 deficiencias en su programa de monitorización ambiental

Durante mucho tiempo, los microbiólogos supusieron que cualquier bacteria que no creciera en un medio de cultivo normal estaba muerta. Mediante investigaciones posteriores se reveló que existe un tercer estado aparte del cultivable y el muerto: el viable no cultivable (VNC). En general, las bacterias en el estado VNC no se multiplican, pero siguen vivas, como lo demuestra su actividad metabólica. Lo más interesante para nosotros es el hecho de que puedan llegar a ser cultivables tras la resucitación y, por tanto, proliferar en los alimentos. Además, algunas bacterias patógenas no crecerán en ausencia de un anfitrión y solo necesitarán sobrevivir en los alimentos hasta su ingestión para causar la enfermedad.Hay muchas razones por las que las bacterias pueden entrar en el estado VNC. La inanición, la incubación fuera del intervalo de temperatura óptimo para el crecimiento, las concentraciones osmóticas elevadas, los niveles de concentración de oxígeno o la exposición a la luz blanca son solo algunas de las causas. Los rasgos específicos de la cepa bacteriana en cuestión determinan qué es lo que hace que las bacterias entren en este estado. 

¿Por qué deberían preocuparle?
Algunas bacterias capaces de entrar en el estado VNC son motivo de preocupación para los fabricantes de alimentos. Aunque todavía no conocemos todas las especies de bacterias que pueden convertirse en VNC, sabemos de algunas que sí lo hacen; entre ellas se encuentran microorganismos indicadores (como Klebsiella aerogenes y Klebsiella pneumoniae), microrganismos adulterantes (como Lactobacillus plantarum y Lactococcus lactis) y microrganismos patógenos (como Salmonella typhimurium, Campylobacter coli o Listeria monocytogenes).
Una vez identificadas, debemos preguntarnos si estas bacterias podrían volver a un estado totalmente cultivable y potencialmente patógeno. Los microbiólogos permanecieron durante mucho tiempo a oscuras con respecto a esta cuestión, ya que es difícil separar completamente las bacterias VNC de las cultivables. Los investigadores han resuelto este problema, en parte, utilizando un enfoque estadístico: diluyen un alto número de bacterias VNC hasta el punto de que es casi imposible que quede alguna bacteria cultivable. Las bacterias se cuentan después de un período de tiempo definido. Si se observan altos grados de crecimiento, la única conclusión posible es que las bacterias han abandonado el estado VNC y se han vuelto cultivables. Otro corolario es que, si pueden volver a un estado cultivable, también pueden volverse patógenas de nuevo. Hay ejemplos de este fenómeno en concreto que han ocasionado brotes epidémicos. Por ejemplo, se sospechaba de E. coli O157 VNC en un brote epidémico en Japón en 1997, ya que las cantidades totales de E. coli eran insignificantes y cepas shigatoxigénicas como O157 podrían causar enfermedades en cifras muy bajas.
 

Las bacterias anaerobias o, de manera más general, los microrganismos anaerobios, pueden dividirse en tres grupos: estrictos, aerotolerantes y facultativos. Como su nombre indica, cada uno de ellos tiene requisitos especiales con respecto al aire o, más concretamente, el oxígeno que los rodea. Los anaerobios estrictos, como Clostridioides difficile, se ven perjudicados por el oxígeno y mueren poco después de la exposición. Las bacterias aerotolerantes, como Clostridium botulinum, no pueden utilizar el oxígeno, por lo que no morirán ni crecerán en su presencia. Los anaerobios facultativos pueden utilizar el oxígeno, pero no lo necesitan para crecer, como es el caso de E. coli. Asimismo, existe el grupo de bacterias microaerófilas, como Campylobacter, que necesitan oxígeno para crecer, aunque en cantidades mucho más pequeñas (1-2 %) que, en el aire normal, pero pueden inhibirse en condiciones aeróbicas. 

¿Por qué deberían preocuparle?
Varias bacterias patógenas tienen estos requisitos especiales de crecimiento. Actualmente, las especies de Campylobacter termotolerantes son motivo de preocupación entre los profesionales sanitarios. En promedio, uno de cada dos pollos está infectado con Campylobacter, lo que hace que la carne de aves de corral sea una de las causas más comunes de intoxicación alimentaria. En la UE, las enfermedades causadas por las especies de Campylobacter se producen con el doble de frecuencia que las causadas por Salmonella. Del grupo anaerobio, una especie de Clostridia, como C. botulinum, es responsable de la enfermedad de origen alimentario conocida como botulismo, a menudo transmitida a través de alimentos enlatados (es decir, pobres en oxígeno), en los que C. botulinum puede desarrollarse y producir la toxina botulínica, que es nociva para los seres humanos. Otra especie de Clostridia, C. perfringens, es la fuente más común de intoxicación alimentaria en Estados Unidos y Canadá, y causa síntomas como calambres abdominales y diarrea. El riesgo de infección por C. perfringens se correlaciona especialmente con los alimentos mantenidos o conservados en condiciones de calor durante mayores períodos de tiempo, lo que favorece su crecimiento hasta alcanzar cifras infecciosas (10⁴ UFC/g).

Algunas estimaciones indican que solo el 1 % de las bacterias puede cultivarse con el conocimiento y las técnicas de las que disponemos actualmente. La «gran anomalía del recuento en placa» es el término que utilizamos para describir la observación de que los recuentos de células microscópicas son significativamente más altos que los correspondientes recuentos de «unidades formadoras de colonias» en placas de agar. Un par de ejemplos pueden ilustrar mejor este fenómeno: mientras que el 50 % de los microrganismos de la flora bucal puede cultivarse con placas de agar, la mayor parte de la flora gastrointestinal no puede cultivarse en absoluto. Las razones de ello son numerosas, pero la comunidad de microrganismos que rodea a la especie en cuestión, incluidas otras bacterias, así como también plantas y animales, puede desempeñar un papel importante. 
Los métodos de recuento de aerobios en placa dependen de medios de cultivo muy generales, que no fomentan el crecimiento de la mayor parte de los grupos de bacterias. En teoría, esto no es realmente parte de la gran anomalía del recuento en placa, ya que algunas bacterias son capaces de crecer en placas de agar especiales en condiciones especiales (como las condiciones anaeróbicas o microaerófilas).

¿Por qué deberían preocuparle?
La gran anomalía del recuento en placa no plantea problemas significativos en los análisis diarios, puesto que los recuentos de aerobios en placa de microrganismos indicadores son específicos de un ambiente de producción dado y, como tales, siempre están relacionados con un valor de referencia determinado para ese ambiente de producción.
Sin embargo, los métodos de placas requieren mucho tiempo, ya que necesitan un período de incubación de hasta tres días, dependiendo del protocolo en vigor. Existen métodos directos que no requieren un paso de cultivo para contar las bacterias; los microscopios proporcionan una visión completa de las bacterias, pero también consumen mucho tiempo. Aunque los métodos directos como la citometría de flujo son habituales en las instalaciones de tratamiento de aguas, no lo son en la industria alimentaria.
 

Las bacterias psicrotróficas pueden crecer a temperaturas tan bajas como 0 °C, con temperaturas de crecimiento óptimas y máximas por encima de los 15 °C. Esto hace que estos microbios sean especialmente problemáticos para alimentos y bebidas, como la carne cruda y la leche conservadas a bajas temperaturas durante largos períodos de tiempo. Los grupos psicrotróficos de bacterias que se encuentran con mayor frecuencia en los alimentos son los géneros gramnegativos Pseudomonas, Aeromonas, Achromobacter, Serratia, Alcaligenes, Chromobacterium y Flavobacterium, así como géneros grampositivos, como Bacillus, Clostridium, Corynebacterium, Streptococcus, Lactobacillus y Microbacterium. También se sabe que Listeria monocytogenes y algunas cepas de Clostridium botulinum pueden proliferar en temperaturas de refrigeración.

¿Por qué deberían preocuparle?
Las bacterias psicrotróficas son microrganismos adulterantes y pueden disminuir significativamente la calidad y la vida útil de los alimentos. Las instalaciones de producción refrigeradas y los tanques de almacenamiento ofrecen un ambiente favorable para la multiplicación de estas especies de bacterias. En la leche refrigerada, p ej., Pseudomonas fluorescens puede producir tanto proteasas como lipasas. Por lo tanto, se considera que las especies que pertenecen al género Pseudomonas son típicamente responsables de las dificultades tecnológicas, ya que las proteasas y las lipasas que producen pueden hacer que la grasa y las proteínas de la leche se degraden, lo que otorga a la leche un color grisáceo y un sabor amargo. Las especies de Pseudomonas son los microrganismos responsables en la mayoría de los casos de la putrefacción de la carne refrigerada conservada en un ambiente aeróbico. Es bien sabido que las especies de Pseudomonas son muy resistentes y capaces de soportar condiciones ambientales estresantes que inhibirían el crecimiento de otros microrganismos de putrefacción. En la carne cruda refrigerada y envasada al vacío, la microflora está dominada en su mayor parte por bacterias psicrotróficas del ácido láctico. Además, el crecimiento de microrganismos patógenos durante el almacenamiento en refrigeración puede causar enfermedades graves.
 

Los microrganismos pueden colonizar superficies mediante la formación de una matriz polimérica en la que puede haber presentes múltiples especies microbianas; esto es lo que se conoce como biopelícula. Hay pruebas que demuestran que la capacidad de formar biopelículas y sobrevivir en estas no se limita a grupos específicos de microrganismos. De hecho, la gran mayoría de bacterias puede formar biopelículas. Por tanto, las biopelículas pueden estar compuestas de monocultivos o de varias especies diferentes de microrganismos. Algunos investigadores han sugerido que la compleja estructura de las biopelículas mixtas las hace más estables y más resistentes a los productos químicos de limpieza. La población inicial que se une a la superficie puede cambiar las propiedades de dicha superficie, lo que permite a las bacterias que aparezcan posteriormente unirse mediante adhesión intercelular; en algunos casos, la unión de una segunda especie puede aumentar la estabilidad de la población de la biopelícula. Por ejemplo, ciertos estudios demuestran que es más probable que L. monocytogenes se adhiera al acero en presencia de Pseudomonas.

¿Por qué deberían preocuparle?
Las biopelículas que se forman en el equipo de procesamiento de alimentos y en otras superficies que entran en contacto con los alimentos son una fuente persistente de contaminación, lo que supone una amenaza para la calidad y la seguridad generales de los productos alimenticios y puede ocasionar enfermedades de origen alimentario, así como pérdidas económicas. Se sabe que los microrganismos de putrefacción son responsables de casi un tercio de las pérdidas en las cadenas de suministro de alimentos, por lo que la prevención y el control de las biopelículas es una prioridad para la industria alimentaria. Los microrganismos que se forman o proliferan en biopelículas son más resistentes a la desinfección, por lo que suponen un problema en un amplio abanico de industrias alimentarias. Otros efectos de las biopelículas, como la corrosión de las superficies metálicas, son otra preocupación crítica para estas industrias. En cualquier caso, la presencia de biopelículas en una fábrica de alimentos pone en riesgo la salud humana. El grado de riesgo depende de las especies de bacterias que formen esta estructura tridimensional viva.

¿Cómo cubrimos estas deficiencias?  El potencial de la citometría de flujo
Por lo general, los fabricantes de alimentos no disponen de muchas opciones. Las que ofrecen un mínimo de precisión, como la tinción vital en combinación con microscopios, pueden cuantificar las bacterias VNC, pero requieren mucho tiempo y un equipo especial. Todos los grupos de bacterias anaerobias y microaerófilas, con la notable excepción de los anaerobios facultativos, pueden crecer en las clásicas placas de agar, pero solo con niveles de oxígeno cuidadosamente controlados.
No obstante, las placas de agar no son la panacea. En las placas de agar se puede contar solo aproximadamente el 1 % de las especies de bacterias conocidas y se tarda días en obtener los resultados, hasta 10 días en el caso de las bacterias psicrotróficas. Los métodos de ATP, aunque son rápidos, no cuantifican las bacterias y solo tienen una utilidad limitada a la hora de detectar bacterias de biopelículas; los datos cinéticos de células planctónicas en suspensión libre no deben utilizarse como referencia, ya que la liberación de ATP es mucho menor en las biopelículas. Además, las trazas de ATP procedentes de residuos alimentarios u hongos pueden ocultar fácilmente el ATP liberado por bacterias, puesto que las células eucariotas contienen 10 millones de veces más ATP que las células procariotas. En consecuencia, los dispositivos de ATP utilizados para detectar biopelículas suelen tener un límite de detección mucho más alto, lo que implica que no son tan sensibles como lo serían en la detección de bacterias de libre flotación . 
Cada uno de estos cinco casos demuestra lo difícil que puede llegar a ser detectar bacterias y residuos en las superficies de producción de alimentos; las carencias de los métodos de detección más habituales, como las pruebas en placa y de ATP, están bien documentadas, pero son difíciles de abordar.
¿Qué pueden hacer los productores de alimentos para cubrir las deficiencias de los métodos de cultivo y los ensayos de ATP? En el siguiente artículo, mi compañero Cristian Ilea habla sobre el potencial de la citometría de flujo por impedancia y el citómetro de flujo CytoQuant^®, una nueva solución que cuantifica inmediatamente las bacterias y las partículas de residuos en las superficies.