Citometría de flujo por impedancia y su uso en la monitorización de los entornos de procesamiento de alimentos

¿Qué es la citometría de flujo, cómo funciona y qué aplicación tendría en la monitorización de los entornos de procesamiento de alimentos? Florin Soptica y Stefan Widmann responden a estas y otras preguntas.

¿Qué es la citometría de flujo?

[Translate to Spanisch:] Bacteria (in red) and particles flow through the microfluidic channel of the cytometer.

La citometría de flujo se refiere a un grupo de técnicas que usa un láser o un campo eléctrico para contar las células suspendidas en un líquido y para determinar algunas de sus propiedades físicas o químicas. De manera óptima, las células fluyen de una en una a través del canal microfluídico del citómetro, el cual detecta variaciones en la longitud de onda de la luz o en la carga eléctrica mientras las células u otras partículas lo atraviesan. Puesto que, para la citometría de flujo, generalmente se necesitan dispositivos grandes y caros, así como exigentes etapas de preparación, el método se ha limitado tradicionalmente al uso en laboratorios en campos de aplicación como la investigación o la medicina.

Utilizar la citometría de flujo por impedancia para contar tanto células como partículas de residuos

[Translate to Spanisch:] Microelectrodes in the microfluidic flow channel generate electrical fields at high and low frequencies.
[Translate to Spanisch:] Bacteria and particles influence the electrical field as they flow between the electrodes.
[Translate to Spanisch:] The unique fingerprint of bacteria: the electrical field can only penetrate the cell membrane of bacteria at high frequencies. At low frequencies, the isolating quality of the membrane prevents this.
 

La citometría de flujo por impedancia se deriva de la tecnología en la que se basan los contadores de partículas Coulter, que pueden contar las partículas suspendidas en electrolitos y determinar su tamaño mediante los cambios en la impedancia causados por el desplazamiento de los electrolitos por las partículas. Al medir al mismo tiempo frecuencias múltiples de cada partícula que pasa, la citometría de flujo por impedancia puede discriminar entre partículas no solo por su tamaño, sino también por sus propiedades eléctricas. Esto supone una potente variante de la citometría de flujo, ya que es muy robusta y puede utilizarse para evaluar las características celulares que, de otro modo, no se podrían determinar sin el uso de marcadores moleculares, como la integridad de la membrana celular. Por tanto, el lugar de un láser, un citómetro de flujo por impedancia utiliza una corriente alterna, y sus distintas frecuencias permiten al dispositivo detectar células con la membrana intacta y otras partículas, medir su tamaño y contarlas por separado. En comparación con otros dispositivos de citometría de flujo, los citómetros de flujo por impedancia pueden ser ligeros, portátiles y funcionar con batería, lo que permite su uso en el lugar en el que se toma la muestra. ¿Cómo distinguen los citómetros de flujo por impedancia entre las células y otras partículas?
La citometría de flujo por impedancia aprovecha las propiedades electromagnéticas únicas de la membrana celular y el citoplasma para distinguir a las bacterias de otras partículas. La membrana y el citoplasma de una célula influyen en el campo eléctrico de una forma diferente a la de otras partículas de la muestra. Un ejemplo con partículas metálicas (conductoras), partículas no conductoras y células intactas puede ilustrar este principio más claramente. Independientemente de la frecuencia del campo eléctrico, la conductividad de las partículas metálicas permitirá que el campo eléctrico pase sin impedimentos. Por el contrario, las partículas no conductoras, como el poliestireno, resistirán el campo eléctrico; la corriente solo avanzará en el medio líquido, lo que provoca un desplazamiento del volumen medible correlacionado con las partículas del canal de flujo. Sin embargo, las células intactas son únicas porque se asemejan tanto a partículas no conductoras como a partículas metálicas, dependiendo de la frecuencia del campo eléctrico. A bajas frecuencias, la cualidad aislante de la membrana de una célula impide que el campo eléctrico penetre en ella, lo que provoca el mismo tipo de desplazamiento que con las partículas no conductoras. En cambio, las frecuencias más altas pueden penetrar parcialmente la membrana; así, las células tienen una conductividad similar a la de las partículas metálicas. Los microelectrodos de los citómetros de flujo por impedancia generan campos tanto a baja como a alta frecuencia, lo que permite al dispositivo detectar estos cambios en la conductividad y la resistencia y asignarlos con cifras precisas a células intactas o a otras partículas. El detector identifica el objetivo como una bacteria sobre la base del grado variable de impedancia o conductividad en estas frecuencias. El usuario recibe entonces recuentos separados de células intactas y otras partículas.
 

Comparación de la citometría de flujo por impedancia con los métodos de cultivo

Los métodos de cultivo, en concreto el uso de placas de agar, son el método tradicional para monitorizar el saneamiento de los entornos de procesamiento de alimentos. 
No obstante, los métodos de cultivo, aunque están bien establecidos, presentan ciertas desventajas con respecto al tiempo que requieren y su ámbito de aplicación. Los métodos de cultivo son lentos, ya que necesitan entre uno y diez días para que las bacterias ormen bacterias cuantificables. Estos métodos solo miden aquello que es cultivable en las condiciones específicas de un análisis dado; una especie u otros grupos de bacterias pueden requerir un agar específico o un medio líquido a una temperatura, un grado de iluminación o una humedad exactos, entre otras variables. Además, los métodos de cultivo no pueden utilizarse para la medición global de todas las bacterias que haya en una muestra. La «gran anomalía del recuento en placa», un enigma muy conocido en microbiología, señala que, mediante el cultivo, solo puede recuperarse una pequeña fracción de bacterias en un hábitat. Las bacterias en un estado viable no cultivable (VNC) están vivas, pero, debido al estrés, a idiosincrasias o a unos factores ambientales subóptimos, no pueden crecer en agar ni en medios de cultivo líquidos. En algunos casos, pueden cultivarse tras la resucitación, un proceso que, de nuevo, requiere tiempo. Se sabe que algunas bacterias patógenas, como <em>E. coli</em> O157, entran en un estado VNC y proliferan en etapas posteriores de la cadena alimentaria o en los anfitriones humanos tras la ingestión.
Además, las bacterias anaerobias y microaerófilas requieren la ausencia de oxígeno o una concentración de este inferior a la de las condiciones atmosféricas normales, respectivamente. Las bacterias de estos grupos que son cultivables requieren unas condiciones de incubación especiales, lo que incrementa el coste de los análisis.  
Los citómetros de flujo por impedancia cuentan todas las bacterias que pasan a través del canal de flujo, independientemente de su estado (cultivable, VNC, no cultivable o latente) o de sus necesidades para el crecimiento. Estas cuantificaciones directas e inmediatas amplían el alcance de los programas de control de higiene; con la citometría de flujo por impedancia también se pueden identificar las bacterias que no se multiplican hasta que entran en contacto con los alimentos o con posibles anfitriones. Además, permite que se tomen medidas inmediatas cuando la limpieza y la desinfección no funcionan según lo previsto. 

Este artículo se encuentra en la Publicación Spot On #15

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