Creando Calibradores Líquidos para Micotoxinas: Una mirada detrás de escena

Muchos laboratorios acreditados utilizan materiales de referencia para demostrar la trazabilidad y la fiabilidad de sus resultados analíticos. Lo que no se conoce mucho, es cómo se fabrican estos materiales de referencia.

La descripción de materiales de referencias o calibrantes, se refiere a sustancias u objetos con una o más características definidas que se usa como punto de referencia para una medición. Debido a la importancia de la inocuidad de los alimentos y raciones para los consumidores, el análisis de micotoxinas involucran materialesde referencia para obtener resultados más confiables.

Peligros omnipresentes

Las micotoxinas son metabolitos fúngicos secundarios, tóxicos para humanos y animales. Los hongos pueden desarrollarse tanto en el campo como durante el almacenamiento. Se encuentran en la mayoría de los cultivos en todo el mundo, y se han identificado más de 380 micotoxinas, y la toxicidad de las mismas varía mucho entre ellas. Las concentraciones máximas admitidas para varias micotoxinas en materias primas como ser trigo y maíz – para mencionar algunas – ha hecho que los productores deban examinar sus muestras con mucho cuidado en los laboratorios analíticos, para estar seguros de la calidad del producto.

Preparación por gravimetría

Frecuentemente, un hongo que se desarrolla bajo condiciones óptimas – temperaturas suficientemente cálidas, humedad alta y un sustrato adecuado – puede elaborar micotoxinas. En el laboratorio, la historia del material de referencia comienza con el ajuste artificial de las condiciones de crecimiento, para obtener un óptimo rendimiento en micotoxinas. Esto incluye utilizar un género adecuado de hongo – como cada hongo produce su propio patrón característico de metabolitos, que pueden llegar a ser cientos. El mantenimiento de la cepa fúngica para producción, es crucial. Su vitalidad y funcionalidad están siendo constantemente monitoreadas, dado que es la base para el proceso de producción de materiales de referencia. Los hongos son organismos vivos que pueden sufrir mutaciones con el tiempo, o pueden degenerarse y reducir la cantidad de micotoxinas producidas. Pueden formarse nuevos metabolitos luego de cierto período de almacenamiento,que pueden influir en el proceso de aislamiento. Las cepas deben renovarse regularmente de manera tal deprevenir las mutaciones, impurezas u otras características no deseadas.

El primer paso, la fermentación, depende completamente del entorno del laboratorio, y de cuan favorable es para la promoción del desarrollo de los hongos. El medio óptimo para el crecimiento, puede variar entre cepas, se provee de componentes como sales y minerales como fuente de nutrientes. Se deja desarrollar el hongo durante un cierto tiempo – que puede ser pocos días o hasta un par de semanas – durante el cual el hongo metaboliza el medio.
Luego de completar la fermentación, y con un cuidadoso control del proceso, se extraen las micotoxinas del medio de cultivo utilizando solventes orgánicos adecuados. Dependiendo de la estructura molecular, estos solventes pueden ser polares o no polares. Durante la fermentación, los hongos pueden elaborar otros componentes además de la toxina de interés, como ser metabolitos, cromógenos, aceites, etc. El extracto resultante, contiene muchas impurezas, durante los pasos de aislamiento o purificación, se busca alcanzar una pureza >98% a través de varias cromatografías y aplicaciones preparativas con diferente selectividad.
Algunas toxinas tienen estructuras moleculares favorables, lo que permite su cristalización a partir de soluciones sobre saturadas de solventes orgánicos polareso no polares. Esto puede ocurrir, por ejemplo, enfriandola solución, por evaporación, o por mezcla de solventes de diferentes polaridades. Otras toxinas pueden cristalizarse por congelamiento. La cristalización permite el incremento de la pureza hasta el valor deseado.

Control de Calidad

HPLC, fotometría UV y HPLC-MS se utilizan para determinar/confirmar la pureza del material producido. Dependiendo de la toxina, esto puede hacerse por HPLC en combinación con una detección por Arreglo de Diodos (DAD) o por fluorescencia (FLD), con Fotometría UV P (análisis cualitativo y cuantitativo del compuesto) o HPLC don detección por espectrometría de masas. La MS, es necesaria en particular, para determinar la pureza isotópica (> 98% átomos de 13C) de las micotoxinas marcadas con isótopos de 13C.
Los materiales de referencia para micotoxinas, tienen una posición de nicho en el mercado. Por lo tanto, algunas veces es difícil encontrar, a nivel comercial, sustancias para hacer las comparaciones y que puedan emplearse durante el control del proceso y control de calidad.

La Tabla 1 indica un número de desafíos que pueden presentarse durante la producción y las etapas de QC, junto con las soluciones implementadas por RomerLabs.

Entrega

Luego de pasar el control de Calidad final, la micotoxina sólida se lleva a solución para utilizarla como un material de referencia líquido. La solución calibrante líquida, es envasada y se genera un certificado de análisis, donde se establece la magnitud y la incertidumbre que acompañan a cada calibrador.

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