Technologies d’analyse rapide de l’hygiène environnementale: présentation détaillée

Satisfaire aux normes d’hygiène est indispensable, tout comme contrôler la conformité de ces normes. Stefan Widmann vous explique en détail les méthodes de contrôle de l’hygiène les plus courantes, afin que vous puissiez sélectionner la plus adaptée à votre environnement de production.

Les techniques de contrôle environnemental courantes reposent généralement sur l’une de ces deux approches : l’analyse des résidus ou l’analyse des micro-organismes. Ici, nous étudierons les différentes technologies disponibles pour chaque approche, leur principe de fonctionnement, leur applicabilité ainsi que leurs avantages.

Analyse des résidus

Méthodes d’ATPmétrie

L’adénosine triphosphate (ATP) est un nucléotide utilisé comme coenzyme dans les cellules afin de libérer de l’énergie. Elle peut être considérée comme une « unité monétaire » permettant le transport d’énergie à travers les cellules vivantes. Cette énergie est nécessaire pour toutes les activités cellulaires, notamment la synthèse des protéines et des membranes, ou encore le mouvement des cellules et leur division. L’énergie est transférée lorsque l’ATP se clive en adénosine diphosphate et adénosine monophosphate. L’hydrolyse des liens covalents des phosphates libère l’énergie utilisée pour les réactions.

Les systèmes d’ATPmétrie disponibles dans le commerce exploitent la réaction luciférine/luciférase, très fréquente dans la nature, pour générer de la lumière visible avec l’énergie libérée par l’ATP. Plus l’émission lumineuse est importante, plus il y a d’ATP et donc de résidus alimentaires et de micro-organismes. Mais attention : ces systèmes étant largement utilisés pour valider l’efficacité du nettoyage, des désinfectants interviennent souvent dans la réaction. Ces désinfectants peuvent perturber les parois cellulaires des micro-organismes mais conserver leur ATP : il est donc possible qu'il n'y ait pas de réelle corrélation entre les organismes vivants présents à la surface et les résultats de l’ATPmétrie.
Les méthodes fondées sur l’ATP présentent un autre inconvénient potentiel : leur applicabilité varie en fonction des résidus alimentaires à détecter. Par exemple, l’ATPmétrie ne se prête pas à l’analyse de la farine de blé car il s’agit d’une matrice extrêmement transformée dont les résidus ne renferment que peu d’ATP . En revanche, les résidus de produits carnés contiennent des taux élevés d’ATP.

Méthodes de détection des protéines totales

Il s’agit d'une autre approche de l’analyse des résidus qui ne détecte pas  les micro-organismes proprement dits mais plutôt les acides aminés, les peptides et les protéines. Très rapides, ces tests permettent d’obtenir des résultats en l’espace d’une minute. Leur sensibilité est cependant insuffisante pour détecter les protéines issues de micro-organismes unicellulaires. L'obtention d’un résultat négatif à ce type de test n’indique donc pas l’absence de micro-organisme. En outre, cette méthode ne permet en aucun cas la détection d’agents pathogènes spécifiques. Les kits de détection des protéines ont néanmoins leur utilité car ils sont un moyen rapide et peu coûteux d’obtenir des indications sur l’efficacité du nettoyage.

Analyse des micro-organismes

Culture sur milieu chromogène

Approches conventionnelles de contrôle de l’hygiène dans les environnements de transformation, les méthodes de culture sont régies par la norme ISO 18593 « Microbiologie des aliments - Méthodes horizontales pour les techniques de prélèvement sur des surfaces ». La détection d’organismes spécifiques peut se faire dans des milieux sélectifs ou non.

Culture sur gélose chromogène

En règle générale, il existe deux façons de réaliser des analyses sur gélose : directement, ou indirectement en passant par une étape de dilution. Les deux ont pour avantage de fournir des résultats quantitatifs.

Dans les méthodes directes, la gélose des lames classiques ou bi-gélosées est simplement pressée sur la surface à échantillonner. Les lames de contact ont la forme de boîtes de Pétri classiques et présentent généralement une surface de 25 cm2. Les lames bi-gélosées sont recouvertes de gélose sur les deux faces et protégées par un tube en plastique. La surface de gélose sur chaque face représente 7 à 10 cm2, ce qui équivaut à 14 à 20 cm2 au total. Ces systèmes n’exigent aucun autre équipement et la procédure d’échantillonnage est très rapide. En cas de recours à cette méthode, la surface d’échantillonnage reste toutefois limitée.

Les écouvillons, chiffonnettes et éponges constituent les outils employés pour l'échantillonnage indirect. Une fois les échantillons prélevés par frottement sur la surface à tester, ils sont dilués dans une solution tampon, puis pipetés dans des boîtes de Pétri classiques et étalés. Les méthodes indirectes permettent de tester une surface bien plus large ainsi que les petits espaces et les interstices. Elles présentent néanmoins un inconvénient : des étapes de manipulation plus nombreuses et du matériel supplémentaire. Pour la détection des agents pathogènes, la norme ISO recommande une surface de 1 000 à 3 000 cm2; il n’est possible de travailler sur une telle surface qu’avec des éponges ou des chiffonnettes.

Méthodes de détection sur milieu liquide chromogène

Cette méthode de culture ne sert qu’à détecter, et non à dénombrer, des organismes spécifiques ou des groupes d’organismes, car elle ne fournit pas de résultats quantitatifs. Les méthodes en milieu liquide consistent à prélever les échantillons à l’aide d’un écouvillon puis à les déposer dans des tubes remplis de milieu sélectif. L’incubation dure en moyenne au moins 48 heures pour un résultat supposé négatif. Les échantillons positifs sont identifiés grâce à un changement de couleur ou une fluorescence à une longueur d’onde donnée de l'échantillon enrichi Ces tests sont généralement simples d’utilisation et peu coûteux.

L'inconvénient des systèmes en milieu liquide est leur faible degré de sensibilité, dû à la grande sélectivité du milieu,  dont le but est de supprimer la croissance des autres bactéries. Il existe alors un certain risque : les bactéries de l’environnement de transformation, déjà soumises au stress, peuvent mourir si le milieu d’enrichissement est trop sélectif. D’un autre côté, si la sélectivité est trop faible, il peut s’avérer difficile de détecter des micro-organismes spécifiques à l’aide d’un milieu liquide sélectif seul. L’interprétation des résultats peut devenir complexe et subjective, le changement de couleur ou la fluorescence n’étant pas toujours assez flagrants pour indiquer un résultat concluant. Les méthodes en milieu liquide ont pour principal avantage d’être simples d’utilisation et peu coûteux.

Méthodes ADN

Il existe trois méthodes d’analyse basées sur l’ADN : l’amplification isotherme de l’ADN, la réaction de polymérisation en chaîne (PCR) conventionnelle et la PCR en temps réel. Alors que la PCR en temps réel est une méthode de détection de l’ADN ou de l’ARN bien établie, l’amplification isotherme est une technologie plus récente. Recourir à l’amplification isotherme plutôt qu’à la PCR en temps réel présente des avantages évidents : par exemple, l’amplification isotherme ne nécessite pas de thermocycleur car la réaction a lieu à température constante. Parmi les méthodes détectant l’ADN, la PCR conventionnelle est la plus économique mais aussi celle qui exige le plus de travail : elle suppose, en effet, une étape d’hybridation ou l’utilisation d’un colorant assez peu spécifique après l’amplification afin de détecter l’ADN ou l’ARN amplifié.

Quelle que soit la méthode, des fragments spécifiques d’ADN ou d’ARN sont reconnus par des amorces particulières puis multipliées par une enzyme, la polymérase. La sensibilité de ces méthodes est remarquablement élevée, et les régions ciblées dans l’ADN et l’ARN bien connues. Le fait que ce système repose sur les enzymes constitue néanmoins sa plus grande limite. Pour fonctionner correctement, les enzymes ont besoin de solutions tampons bien précises. Les composants des désinfectants peuvent influencer l’activité des enzymes, ce qui peut générer des résultats faux négatifs. Cette technologie suppose également de nombreuses étapes de micropipetage qui peuvent s’avérer une source importante d’erreur.

Le plus gros avantage des méthodes ADN est qu’elles permettent, grâce à leur forte sensibilité, d’utiliser un milieu non sélectif pour les étapes d’enrichissement. Les milieux non sélectifs sont peu coûteux, disponibles chez différents fournisseurs et ne requièrent que le niveau de biosécurité le plus bas (niveau 1). Il est également possible de détecter de faibles quantités d’agents pathogènes sur des surfaces environnementales sans enrichissement avec les méthodes ADN. Cependant, la sensibilité est inférieure par rapport aux méthodes d’enrichissement. Enfin, les faux positifs résultant de la détection de fragments d’ADN d’agents pathogènes  déjà tués peut aussi poser un problème conséquent.

Méthodes immunologiques

Les immuno-essais sont des systèmes qui utilisent les anticorps pour détecter la présence de micro-organismes dans des solutions. Ces anticorps peuvent se lier à des antigènes, comme les lipopolysaccharides à la surface des cellules ou le flagelle de certains micro-organismes. À l’issue d’une procédure d’enrichissement simple ou multiple incluant des milieux sélectifs, les agents pathogènes tels que les Listeria sont détectés à l’aide de systèmes d’analyses reposant sur la détection d’anticorps spécifiques.

Les tests ELISA (dosage immuno-enzymatique) ont été les premiers à exploiter la technologie immunologique pour détecter des micro-organismes spécifiques. La méthode ELISA permet la quantification de l’analyte détecté, mais la nécessité d’inclure une étape d’enrichissement proscrit tout calcul de la concentration initiale. Seul du personnel formé peut mener à bien les différentes étapes de transfert et de rinçage qu’exige ce type de tests. Le développement des dispositifs immunochromatographiques, également appelés tests sur bandelette, a résolu ce problème en rendant la procédure de détection immunologique nettement plus simple et plus rapide, et en éliminant la charge de travail associée aux tests ELISA. Les bandelettes avec anticorps sélectifs utilisées avec un milieu d’enrichissement haute performance offrent des résultats rapides et précis sans aucun équipement onéreux ni coût de formation.

Conclusion

Choisir la technologie de contrôle de l’hygiène la plus adaptée n’est pas toujours chose aisée. Plusieurs questions pratiques influenceront cette décision : combien de sites d’échantillonnage doivent être testés et quelle est l’importance du rendement d’analyse ? Comment les contrôleurs peuvent-ils optimiser le délai d’obtention des résultats, sachant que l’analyse de certaines bactéries pathogènes n’est pas réalisée tous les jours et relève davantage d’une opération de surveillance que d'une procédure de contrôle qualité ? S’agit-il d’obtenir des résultats quantitatifs ou un test de présence/absence est-il suffisant ? Dans la mesure où il n’est toujours pas possible de dénombrer les bactéries immédiatement après le nettoyage, les fabricants peuvent se fier à des systèmes d’analyse par ATPmétrie ou détection des protéines, qui peuvent vaguement indiquer si la production peut être lancée en toute sécurité (selon la présence ou l’absence d’ATP ou de protéines).

Les réglementations en vigueur dans le pays peuvent également influer sur ce choix. Les méthodes ADN avec enrichissement ou immunologiques sont supérieures aux autres en termes de sensibilité et de sélectivité, et doivent être privilégiées pour la détection des agents pathogènes. Des dispositifs moins coûteux comme les lames bi-gélosées ou les systèmes d’ATPmétrie peuvent être utilisés pour détecter et dénombrer les organismes indicateurs ou assurer le suivi de l’hygiène générale.

Cet article a été publié dans notre magazine Spot On #8

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