Amostragem para micotoxinas – nos importamos o suficiente?

Como as micotoxinas são invisíveis, inodoras e insípidas, a única maneira de determinar se grãos ou rações contêm estes compostos indesejáveis é analisá-los. Entretanto, embora haja excelentes métodos analíticos à disposição, é difícil estimar com exatidão e precisão a concentração de micotoxinas em um lote grande a granel, por causa da grande variabilidade associada ao procedimento geral de teste de micotoxinas.

Testar micotoxinas é um processo complicado, que geralmente consiste em três etapas: (1) várias amostras pequenas são tomadas aleatoriamente do lote e dispostas em uma grande “amostra de lote”; (2) toda a amostra de lote é triturada até obter-se partículas finas, e remove-se uma subamostra, a “amostra analítica”, para análise; e (3) as micotoxinas são extraídas da amostra analítica e finalmente quantificadas.
As técnicas analíticas para detecção de micotoxinas tiveram desenvolvimento constante, no passado. Contudo, mesmo usando procedimentos de teste aceitos, há a variação associada a cada uma das etapas mencionadas acima. Estudos de vários cientistas demonstraram que a amostragem geralmente é a maior fonte de variação associada ao procedimento de teste de micotoxinas [1, 2, 4, 5, 6] Aproximadamente 90% dos erros associados ao teste de aflatoxinas, por exemplo, podem ser atribuídos à amostragem. Como tempo e dinheiro têm sido gastos nas análises de micotoxinas, o uso de tempo extra para uma amostragem adequada é crucial para resultados reproduzíveis.
A amostragem deve ser monitorada e as técnicas adequadas devem ser implementadas. Os procedimentos de amostragem devem ser escritos, revisados e seguidos por todos os envolvidos. A alta taxa de erros de amostragem nos testes para micotoxinas deve-se a dois fatores principais: baixa concentração de micotoxinas em um dado produto (o “problema de ppb”) e a distribuição irregular no lote.

O problema de ppb

Apesar dos níveis extremamente altos de micotoxinas em algumas sementes, a concentração geral de micotoxinas em um lote de grãos é geralmente muito baixa. A unidade de medida é normalmente “partes por bilhão” (ppb). Para ilustrar o significado destes níveis baixos, alguns exemplos são apresentados na tabela 1. [3] Lembre-se sempre: as micotoxinas afetam a saúde humana e animal, mesmo a estas concentrações baixas!

1 ppb é…

  • 1 parte em 1.000.000.000
  • 1 segundo em 32 anos
  • 1 grão de areia em 22 kg
  • 1 pé de milho em 40.000 acres de milho
  • 1 semente de milho em 3,5 vagões de trem

Distribuição irregular

Ao contrário das proteínas ou do teor de umidade em milho ou trigo, as micotoxinas não ocorrem em todas as sementes. Em casos extremos, as micotoxinas podem estar presentes apenas em algumas espigas ou hastes de um campo inteiro. Isto significa que algumas sementes podem conter níveis altos de toxinas, enquanto outras não contêm absolutamente nenhuma toxina.
Isto se deve ao fato de que os fungos não crescem uniformemente em um campo ou silo de grãos. Assim, as micotoxinas tendem a se concentrar em certos pontos, chamados “pontos ativos” (hot spots) ou “pepitas” (nuggets), sendo que o restante do lote fica livre de toxinas (Fig.1).
Contudo, quanto maior a extensão da contaminação, maior a probabilidade de uma distribuição mais uniforme. Ao contrário, quando a concentração geral de uma toxina em um lote de grãos é baixa, a distribuição irregular é acentuada [3].

Fig. 1: Distribuição irregular. Os círculos marrons indicam os “pontos ativos”.

Cuidado com “falsos negativos” e “falsos positivos””

Análise correta significa determinar a contaminação média do lote como um todo. Se não forem seguidos os procedimentos de amostragem apropriados, é provável que os resultados analíticos subestimem a concentração real de micotoxinas (ou seja, apenas as áreas não contaminadas ou menos contaminadas são amostradas) ou a superestimem (ou seja, as amostras são tomadas de pontos ativos).

Os resultados falsos negativos são muito comuns nos testes para micotoxinas, em grande parte devido à inadequação da amostragem e de sua preparação. Quando são tomadas muito poucas amostras incrementais ou a amostra total do lote é pequena demais, é muito mais comum “errar” uma das sementes contaminadas que “acertá-la”. Este tipo de resultado é também muito comum quando toda a amostra examinada é dividida antes da trituração. O número de falsos negativos pode variar de 5%, que é o normal, até aproximadamente 90%! Por outro lado, falsos positivos refletem uma resposta mais alta que a representativa. Este tipo de resultado não é tão comum quanto o falso negativo.

Contudo, tanto o falso negativo quanto o falso positivo são prejudiciais, já que causam perdas financeiras consideráveis (tabela 2). [3]

Conseqüências dos falsos negativos e dos falsos positivos.

Falsos negativos...…

  • Os custos para teste de micotoxinas são desperdiçados.
  • Existem custos adicionais de transporte, quando o processador dos grãos posteriormente encontra contaminação por micotoxinas, rejeita a carga e a devolve ao vendedor.
  • O vendedor perde credibilidade e confiança.
  • Podem se seguir processos onerosos, se um produto é processado e efeitos prejudiciais à saúde resultam do consumo do alimento ou da ração.

Falsos positivos...

  • Grãos bons são vendidos a preços mais baixos.
  • A mistura ou o tratamento de grãos bons gera custos desnecessários.
  • Resultados imprecisos refletem mal no programa geral de testes e desencorajam possíveis vendedores de grãos a oferecer grãos para compra.

A amostragem cuidadosa é decisiva para resultados analíticos corretos

A amostragem é definida como o processo de retirada de uma quantidade adequada de um lote grande, para teste, de modo que a proporção e a distribuição dos fatores em teste sejam as mesmas tanto no total (lote) quanto na parte retirada (amostra). A importância de uma amostragem adequada se torna clara quando percebemos, por exemplo, que a maior parte dos vagões contêm de 55 a 80 toneladas, e caminhões aproximadamente 20 toneladas de milho e analisamos, essencialmente, apenas 50 g de amostra triturada, que deve representar todo o lote.

Para assegurar que a amostra de teste seja representativa, devem ser usadas técnicas de amostragem apropriadas. Uma amostra da camada exposta de grãos em um vagão ou caminhão graneleiro, ou uma amostra de “caçamba” de quando o caminhão ou vagão é descarregado NÃO são representativas do lote como um todo e, portanto, não devem ser usadas. As pessoas que coletam os grãos também podem influenciar o modo como a amostra representa o lote de grãos, tomando amostras de apenas uma parte do vapor dos grãos. Por este motivo, a amostragem com concha ou com as mãos não é permitida para inspeções oficiais. A distribuição dos componentes, como sementes quebradas ou material estranho, normalmente não é uniforme em toda a carga. Como os grãos são carregados em um container (caminhão, vagão ou armazém), os componentes dos grãos se separam segundo seu tamanho, densidade e forma.

Durante a carga, as partículas finas tendem a se concentrar na área próxima ao centro e os materiais de tamanho maior migram para fora do container de armazenamento. No descarregamento, ocorre uma separação inversa. Isto explica porque o número de amostras incrementais e o padrão adequado de amostragem são cruciais para garantir que a amostra seja realmente representativa do lote.

A importância de um tamanho adequado de amostra para a precisão do resultado analítico é demonstrada no estudo a seguir (tabela 3). As amostras foram tomadas de um caminhão contendo milho contaminado por 20 ppb de aflatoxina. Tomando-se uma amostra pequena demais, as toxinas são completamente ignoradas ou encontradas em níveis muito mais baixos que os realmente presentes. [3]

Tab. 3: Variabilidade dos resultados de teste em relação ao tamanho da amostra (estudo da Romer Labs®)

Para uma amostra ser considerada representativa, ela deve ser:

  • of appropriate size, which depends on the lot size and the commodity. E.g. a 2.5 to 5 kg sample of corn and a 1.5 to 2.5 kg sample of wheat or barley should be taken from a truck or railcar of grain.
  • obtida usando-se um padrão e procedimentos de amostragem projetados para coletar amostras de todas as áreas do lote (vide figura 2).
  • de tamanho apropriado, o que depende do tamanho do lote e do produto. Por exemplo, devem ser tomadas amostras de 2,5 a 5 kg de milho e de 1,5 a 2,5 kg de trigo ou cevada de um caminhão ou vagão de grãos.
  • devidamente identificada e rotulada no saco.
  • manuseada de modo a manter a representatividade. Isto significa que as amostras devem ser armazenadas em local fresco e seco e entregues em sacos de papel de revestimento duplo ou triplo ou sacos de tecido que permitam respiração. Nunca despache amostras em sacos plásticos, já que podem promover o crescimento de bolor se o nível de umidade da amostra exceder 14%.
Fig. 2: Modelo de amostragem. Os círculos vermelhos indicam pontos que devem ser amostrados; as marcas verdes indicam pontos opcionais de amostragem, em caso de lotes muito grandes. As amostras incrementais devem ser trituradas e misturadas perfeitamente. Uma subamostra de aproximadamente 2 kg deve então ser enviada para o laboratório, para análise.

Amostragem de ração misturada

Quando rações misturadas são amostradas para análise de micotoxinas, são possíveis duas situações:

1. As micotoxinas estavam presentes em um ou mais dos ingredientes da ração, quando a ração é misturada: as micotoxinas são distribuídas de forma mais uniforme na ração que quando estava no ingrediente contaminado, porque o ingrediente foi grosseiramente triturado e misturado à ração. Uma amostra de 1 kg de ração é suficiente para fornecer uma amostra representativa.

2. As micotoxinas foram produzidas na ração após sua mistura, devido a más condições de armazenamento (14% de umidade ou mais): as micotoxinas são geralmente distribuídas de maneira menos uniforme. A ração embolora primeiro nas áreas úmidas do recipiente de armazenamento, e o bolor migra lentamente para as áreas menos úmidas, conforme cresce. Uma boa maneira de amostrar a ração, neste caso, é tomar uma amostra de pelo menos 1 kg das áreas úmidas do recipiente (geralmente as bordas externas e os cantos) e uma amostra de 1 kg do centro. Contudo, para ter certeza absoluta, pressuponha sempre uma distribuição não uniforme!

Dicionário:

  • amostra de lote: several small samples (= incremental samples) taken at random from the lo
  • amostra analítica: sample for analysis taken from the ground lot sample
  • amostragem aleatória: every individual item in the lot should have an equal chance of being chosen 
  • replicabilidade: the same result should be reached again and again when a specific lot is repeatedly analyzed

Literatura:

[1] Coker RD, Nagler MJ, Blunden G, Sharkey AJ, Defize PR, Derksen GB, and Whitaker TB (1995). Design of sampling plans for mycotoxins in food and feeds. Natural Toxins, 3, 257-262.

[2] Park DL, Rua SM, Paulson JH, Harder D and Young AK (1991). Sample collection and sample preparation techniques for aflatoxin determination in whole cottonseed. J Assoc Off Anal Chem Intl, 74, 73-75.

[3] Richard J (2000). Sampling and Sample Preparation for Mycotoxin Analysis. RomerTM Labs’ Guide to Mycotoxins, 2.

[4] Schatzki TF (1995). Distribution of aflatoxin in pistachios. J Agric Food Chem, 1566-1569.

[5] Whitaker TB, Dowell FE, Hagler WM, Giesbrecht FG, and Wu J (1994). Variability associated with sampling, sample preparation and chemical testing of farmers’ stock peanuts. J Assoc Off Anal Chem Intl, 77, 107-116.

[6] Whitaker TB (2003). Standardisation of mycotoxin sampling procedures: an urgent necessity. Food Control, 14, 233-237.

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