Os 7 Pecados dos Testes de OGM

O uso de culturas geneticamente modificadas (GM) é crescente em todo o mundo o

que proporciona muitas oportunidades para a indústria agrícola, ao mesmo tempo em que traz inúmeros desafios à indústria de diagnóstico. Um especialista da Romer Labs compartilha o seu conhecimento sobre teste de culturas GM para que você evite cometer erros comuns em seu laboratório.

1. Identificação do alvo errado

Faça o seu dever de casa: talvez este seja o hábito mais básico que qualquer cientista pode aprender. Isto é particularmente necessário para testar organismos geneticamente modificados (OGM), onde fazer a lição de casa significa saber quais eventos compreendem os seus alvos para que você possa evitar falsos positivos e resultados incorretos.
O problema está relacionado a traços. Um traço é uma proteína derivada de uma modificação genética que confere uma qualidade especial à planta. As modificações genéticas podem estar presentes em diferentes combinações que produzem traços semelhantes ou completamente diferentes. Entre os elementos mais populares das modificações genéticas estão os promotores (p35S, FMV), terminadores (NOSt), genes codificadores para certas características úteis (cp4 epsps, pat, bar, Cry1A, entre outros) e genes que codificam marcadores seletivos (NPTII, PMI).
Os técnicos precisam considerar diferentes fatores ao definir o alvo para qualquer análise de OGM, como o território de onde o produto se origina, se os eventos estão autorizados na região e se a planta de interesse tem traços transgênicos comercialmente disponíveis.
Pode ser complicado: às vezes a modificação existe, mas não é autorizada ou plantada em certas regiões mas pode ser amplamente utilizada em outra região. Além disso, houve casos de eventos não aprovados que saem do isolamento e fazem o seu caminho para o campo.

2. Escolha de um método deficiente ou insuficiente

Pode ser uma decisão arriscada: qual deve ser o escopo de qualquer triagem de OGM? Os laboratórios podem mirar limitadamente alguns elementos genéticos ou proteínas, ou podem expandir o escopo para vários eventos ou proteínas, o que pode ser caro. Encontrar o método que se adapta às suas necessidades e garante resultados precisos é essencial. Os métodos com base no DNA são demorados e dependem da extração de DNA de alta qualidade e controles apropriados. A variação no número de cópias e poliploidia também podem causar problemas nas amostras e devem ser levadas em consideração ao realizar a análise do DNA.
Exemplo: No caso da soja, não é suficiente testar apenas para os promotores e terminadores, uma vez que apenas alguns dentre os 15 potenciais eventos da soja contêm esses elementos genéticos comuns. O milho é uma história diferente: analisar amplamente os promotores e terminadores é praticamente suficiente uma vez que a maioria dos eventos no milho contêm esses elementos. Enquanto os métodos com base no DNA são caros e usados somente em laboratórios de serviços analíticos, a identificação da proteína é relativamente barata e útil na triagem de traços comuns. A maioria dos eventos GM tem o seu próprio nível de expressão de proteína modificada. É necessário ter cautela ao realizar a análise de proteína da soja e canola com o mesmo dispositivo de fluxo lateral (LFD). A Tabela 1 destaca diferentes taxas de expressão de CP4 EPSPS, tornando necessário o uso de diferentes métodos de detecção de LFD. A abordagem correta usa diferentes testes e ajusta a sensibilidade para diferentes produtos para alcançar um nível semelhante de detecção.

3. Not fully understanding different degrees of test sensitivity

DNA-based methods are very sensitive and are able to detect a single copy of the target gene. The sensitivity for DNA-based methods is limited by the number of seeds tested. It is usually 0.01% or one genetically modified (GM) seed in a set of 10,000 non-GM seeds. Such sensitivity is more than enough to be 99.9% sure of any specific level of detection down to 0.1%.
On the other hand, protein-based methods have a limit of detection (LOD) as low as 0.1%, or 1 GM seed in 1,000 non-GM seeds. Yet this sensitivity is not enough to guarantee a result with 99% certainty. The best you can get with a single protein test with an LOD of 0.1% is a level of 0.46% at 99% confidence. The non-uniform distribution of the seeds in real samples leads to this discrepancy. To be 99% certain that the level of GMO contamination is lower than 0.1%, we recommend that you carry out at least four tests of 1,000 kernels at a sensitivity of 0.1% each. For 95% confidence at 0.1%, carry out three tests of 1000 kernels all with negative results.

4. Removing impurities or treating the sample

Grain labs often remove impurities from samples before conducting a test. However, the purification of GMO samples is not allowed. If some residues containing traces of GMO plants are left in the samples, they should be detected. For example, if a corn sample contains some residues of GMO soy (kernels, shells, dust), washing and manual cleaning will remove these residues and produce an incorrect result.
Do not subject the samples to any kind of heat treatment, not even in order to dry excess moisture. For protein-based methods in particular, this could result in the denaturation of the trait proteins and lead to the complete loss of test sensitivity, as the target protein would have changed. Antibodies used in these applications would then no longer be able to recognize their targets.

5. Using an improper procedure to prepare the sample

Your method of DNA isolation should be carefully designed and followed to avoid DNA degradation, which could skew your results. Therefore, it is important to verify the quality and quantity of purified DNA. In addition to the DNA extraction reagents used, the grinding method is also very important. Blade mills give the best results, as they grind finly enough to enable DNA extraction. However, it is imperative to thoroughly clean any grinding equipment after use, as cross-contamination is a huge problem in GMO testing. Equipment that is not properly cleaned could produce false negative results in subsequent batches.
Protein extraction requires a coarser grind. It is enough simply to crush all seeds in the sample. If you grind seeds too finely, it will take too long for the extract to settle, and the sample will contain too many solid particles, which will stick to the LFDs and inhibit the flow of liquid. Mills used for extraction before LFD analysis should be set to avoid causing fractions that are too fine. The shape of the extraction vessel should also be considered: it should not be flat, and it is better to use disposable vessels to avoid cross-contamination. Blenders are very commonly used for grinding for protein testing because they are very easy to clean, therefore avoiding problems with cross-contamination.

6. Customizing testing procedures or failing to read the package insert

This could well be the most serious sin that operators commit. While reference testing labs employ trained staff throughout the whole year, grain labs often have a seasonal employment policy and therefore employ staff with less expertise in testing.
This could lead to the testing procedure being misread, incorrectly followed or altered in the lab. This can affect all parts of the testing process, beginning with extraction and affecting testing elements such as the volumes of liquid required for the test, development times, and analysis procedures.
Make sure you thoroughly read all packaging and documentation before carrying out any analysis to ensure reliable results.

7. Insufficiently cleaning your equipment (causing cross-contamination)

Make sure that the mill you use for GMO analysis is easy to clean. The best way is to use removable jars and blades so that you can clean them separately from the mill motor. Every component of your equipment should be washable. Blenders are commonly used for grinding GMO samples as they are easy to clean. Mills have to be dismantled and all the parts washed separately.
Wash all equipment with liquid soap and rinse with water afterwards. Do not use ethanol as a cleaning agent; its only use is to accelerate the drying process. Each lab should validate its cleaning procedure to ensure efficiency.
We recommend the use of gloves when handling all samples. Changing your gloves and washing your hands between samples will also help to avoid cross-contamination.
Make sure you clean any tools that may have come into contact with the extract of ground material. Another solution is to use disposable equipment as much as possible.

This article was published in our Spot On magazine

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