Os 7 Pecados dos Testes de OGM

O uso de culturas geneticamente modificadas (GM) é crescente em todo o mundo o

que proporciona muitas oportunidades para a indústria agrícola, ao mesmo tempo em que traz inúmeros desafios à indústria de diagnóstico. Um especialista da Romer Labs compartilha o seu conhecimento sobre teste de culturas GM para que você evite cometer erros comuns em seu laboratório.

1. Identificação do alvo errado

Faça o seu dever de casa: talvez este seja o hábito mais básico que qualquer cientista pode aprender. Isto é particularmente necessário para testar organismos geneticamente modificados (OGM), onde fazer a lição de casa significa saber quais eventos compreendem os seus alvos para que você possa evitar falsos positivos e resultados incorretos.
O problema está relacionado a traços. Um traço é uma proteína derivada de uma modificação genética que confere uma qualidade especial à planta. As modificações genéticas podem estar presentes em diferentes combinações que produzem traços semelhantes ou completamente diferentes. Entre os elementos mais populares das modificações genéticas estão os promotores (p35S, FMV), terminadores (NOSt), genes codificadores para certas características úteis (cp4 epsps, pat, bar, Cry1A, entre outros) e genes que codificam marcadores seletivos (NPTII, PMI).
Os técnicos precisam considerar diferentes fatores ao definir o alvo para qualquer análise de OGM, como o território de onde o produto se origina, se os eventos estão autorizados na região e se a planta de interesse tem traços transgênicos comercialmente disponíveis.
Pode ser complicado: às vezes a modificação existe, mas não é autorizada ou plantada em certas regiões mas pode ser amplamente utilizada em outra região. Além disso, houve casos de eventos não aprovados que saem do isolamento e fazem o seu caminho para o campo.

2. Escolha de um método deficiente ou insuficiente

Pode ser uma decisão arriscada: qual deve ser o escopo de qualquer triagem de OGM? Os laboratórios podem mirar limitadamente alguns elementos genéticos ou proteínas, ou podem expandir o escopo para vários eventos ou proteínas, o que pode ser caro. Encontrar o método que se adapta às suas necessidades e garante resultados precisos é essencial. Os métodos com base no DNA são demorados e dependem da extração de DNA de alta qualidade e controles apropriados. A variação no número de cópias e poliploidia também podem causar problemas nas amostras e devem ser levadas em consideração ao realizar a análise do DNA.
Exemplo: No caso da soja, não é suficiente testar apenas para os promotores e terminadores, uma vez que apenas alguns dentre os 15 potenciais eventos da soja contêm esses elementos genéticos comuns. O milho é uma história diferente: analisar amplamente os promotores e terminadores é praticamente suficiente uma vez que a maioria dos eventos no milho contêm esses elementos. Enquanto os métodos com base no DNA são caros e usados somente em laboratórios de serviços analíticos, a identificação da proteína é relativamente barata e útil na triagem de traços comuns. A maioria dos eventos GM tem o seu próprio nível de expressão de proteína modificada. É necessário ter cautela ao realizar a análise de proteína da soja e canola com o mesmo dispositivo de fluxo lateral (LFD). A Tabela 1 destaca diferentes taxas de expressão de CP4 EPSPS, tornando necessário o uso de diferentes métodos de detecção de LFD. A abordagem correta usa diferentes testes e ajusta a sensibilidade para diferentes produtos para alcançar um nível semelhante de detecção.

Tabela 1.

3. Não compreender completamente os diferentes graus de sensibilidade do teste

Os métodos com base no DNA são muito sensíveis e capazes de detectar uma única cópia do gene alvo. A sensibilidade é limitada pelo número de sementes testadas. Geralmente, é 0,01% ou uma semente geneticamente modificada (GM) em um conjunto de 10.000 sementes não GM. Essa sensibilidade é mais do que o suficiente para proporcionar 99,9% de certeza de qualquer nível específico de detecção abaixo de 0,1%. Por outro lado, os métodos com base nas proteínas têm um limite de detecção (LOD) tão baixo quanto 0,1%, ou 1 semente GM em 1.000 sementes não GM. Essa sensibilidade não é suficiente para garantir um resultado com 99% de certeza. O melhor que se pode obter com o teste de uma única proteína com um LOD de 0,1% é um nível de 0,46% com confiança de 99%. A distribuição não uniforme das sementes em amostras reais causa essa discrepância. Para ter 99% de certeza de que o nível de contaminação OGM é inferior a 0,1%, recomendamos a realização de pelo menos quatro testes de 1.000 núcleos a uma sensibilidade de 0,1% cada. Para confiança de 95% a 0,1%, realizar três testes de 1000 núcleos, todos com resultados negativos. 

4. Retirada das impurezas ou tratamento das amostras

Os laboratórios de grãos frequentemente removem as impurezas das amostras antes de realizar o teste. Contudo, a purificação das amostras OGM não é permitida. Resíduos contendo traços de plantas GM deixados nas amostras devem ser detectados. Por exemplo, se uma amostra de milho tiver resíduos de soja GM (núcleos, cascas, poeira), a lavagem e limpeza manual irão removê-los e produzir um resultado incorreto.
Não submeter as amostras a qualquer tipo de tratamento térmico, nem mesmo para retirar o excesso de umidade. Para métodos baseados em proteína, o calor poderia resultar na desnaturação da molécula levando à perda completa da sensibilidade do teste, uma vez que a proteína alvo seria modificada. Os anticorpos usados nessas aplicações não seriam mais capazes de reconhecer os seus alvos.

5. Uso de procedimento inapropriado para preparar a amostra

O método de isolamento do DNA deve ser cuidadosamente desenvolvido e seguido para evitar a degradação do material, o que poderia prejudicar os resultados. Portanto, é importante verificar a qualidade e a quantidade do DNA purificado. Além dos reagentes de extração usados, o método de trituração também é muito importante. Os moinhos de lâminas apresentam os melhores resultados, pois trituram fino o suficiente para permitir a extração do DNA. No entanto, é essencial limpar completamente qualquer equipamento de moagem após o uso, uma vez que a contaminação cruzada é um grande problema nos testes de OGM. Os equipamentos que não são devidamente limpos podem produzir resultados falsos negativos em lotes subsequentes.
A extração de proteína requer uma moagem mais grossa. Basta simplesmente esmagar todas as sementes da amostra. Se você moer as sementes de forma muito fina, demorará muito para que o extrato se assente, e a amostra conterá muitas partículas sólidas, que se fixarão com as LFDs e inibirão o fluxo de líquido. A forma do recipiente de extração também deve ser considerada: não deve ser horizontal e é recomendado o uso de recipientes descartáveis para evitar a contaminação cruzada. Os misturadores são muito comumente usados para moagem em testes de proteína porque são fáceis de limpar evitando problemas de contaminação cruzada.

6. Customização dos procedimentos de teste ou falha ao ler o manual

Este pode ser o pecado mais grave que os operadores cometem. Embora os laboratórios de referência utilizem analistas treinados durante o ano todo, os laboratórios de grãos frequentemente possuem uma política de emprego sazonal e, portanto, utilizam mão de obra com menos experiência.
Isso pode fazer com que o procedimento de teste seja equivocadamente lido, incorretamente seguido ou alterado podendo afetar todas as fases do teste, como a etapa de extração, os tempos de desenvolvimento e os procedimentos de análise.
Certifique-se de ler cuidadosamente toda a documentação e a embalagem antes de realizar qualquer análise garantindo, assim, resultados confiáveis.

7. Limpeza insuficiente do equipamento (causando contaminação cruzada)

Certifique-se de que o moinho utilizado para a análise de OGM seja de fácil de limpeza. A melhor maneira é usar lâminas e frascos removíveis para que você possa limpá-las separadamente do motor do moinho. Cada componente do equipamento deve ser lavado separadamente. Os misturadores são comumente usados para moagem de amostras OGM, pois são fáceis de limpar. Lavar todo o equipamento com sabão líquido e enxaguar com água em seguida. Não usar etanol como agente de limpeza; seu único uso é acelerar o processo de secagem. Cada laboratório deve validar seu procedimento de limpeza para garantir a eficiência.
Recomendamos o uso de luvas ao manusear todas as amostras. Trocar as luvas e lavar as mãos entre as amostras também ajudará a evitar a contaminação cruzada. Certifique-se de limpar as ferramentas que possam ter entrado em contato com material do solo. Outra solução é usar o máximo possível de equipamentos descartáveis.

This article was published in our Spot On magazine

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