Методы быстрой проверки санитарного состояния производственной среды: Подробный обзор

Необходимо установить и соответствовать строгим санитарно-гигиеническим стандартам, а затем контролировать их соблюдение. Stefan Widmann подробно рассказывает о наиболее распространенных видах проверки санитарного состояния производственной среды, чтобы вы смогли выбрать оптимальный метод для своей организации.

Стандартные методы оценки производственной среды можно разбить на две большие группы: определение остаточных веществ и определение микроорганизмов. В этой статье мы рассмотрим различные методы в рамках каждой из групп, их механизм действия, применимость и преимущества.

Определение остаточных веществ

Методы на основе АТФ

Аденозинтрифосфат (АТФ) — это нуклеотид, который используется в клетках как кофермент для обеспечения их энергией. Его можно представить как молекулярную «денежную единицу», которая переносит энергию во всех клетках живых существ. Энергия необходима для любой клеточной активности, в том числе синтеза белков и мембран, движения и деления клеток. Перенос энергии происходит при распаде АТФ на аденозиндифосфат и аденозинмонофосфат. При гидролизе ковалентных связей фосфатов высвобождается энергия, которая расходуется на протекание реакций

В имеющихся на рынке тест-системах с АТФ реакция люциферин/люцифераза, которая очень часто встречается в природе, используется для создания видимого света за счет энергии, поставляемой АТФ. Чем больше света излучается, тем больше АТФ присутствует, что говорит о большем количестве пищевых остатков или микроорганизмов. Но есть одно важное замечание: поскольку эти системы широко используются для контроля эффективности очистки, дезинфектанты также часто принимают участие в реакции. Эти дезинфектанты способны повредить клеточную стенку микроорганизмов с сохранением их АТФ, при этом не будет реальной корреляции между количеством живых организмов на поверхности и результатами измерения количества АТФ.

У методов на основе АТФ есть еще один потенциальный недостаток: их применимость колеблется в зависимости от вида пищевых остатков. Например, методы на основе АТФ не подходят для исследования пшеничной муки, поскольку это вещество подвергается сильной переработке, после которой остается мало АТФ. Однако остатки мясных продуктов богаты АТФ.

Методы определения общего белка

При проверке на остаточные вещества методами определения общего белка проводится исследование не на сами микроорганизмы, а скорее на аминокислоты, пептиды и белки. Эти тесты проводятся очень быстро и дают результат за минуту. Они недостаточно чувствительны для определения белков одноклеточных организмов. Поэтому отрицательный результат таких тестов не говорит об отсутствии микроорганизмов. Кроме того, эти методы не позволяют выявить конкретные патогены. Однако наборы для определения белка находят свое применение, так как позволяют быстро и доступно проверить эффективность очистки.

Определение микроорганизмов

в хромогенной среде

Существуют традиционные методы мониторинга санитарных условий производственной среды. Методы культивирования описаны в ISO 18593 «Микробиология пищевой цепи — Горизонтальные методы отбора проб с поверхности». Для определения конкретных организмов могут использоваться неселективные и селективные среды.

Методы на основе хромогенного агара

Исследование с использованием агара может проводиться прямым способом или непрямым способом после разведения. Преимущество обоих методов в том, что они дают количественные результаты.

В прямых методах агар в чашках или на погружных слайдах непосредственно прижимается к исследуемой поверхности. Контактные чашки имеют форму классических чашек Петри, обычно с площадью поверхности 25 см2. Погружные слайды — это двусторонние агаровые пластинки, помещенные в пластиковый контейнер; площадь агара составляет 7–10 см2 с каждой стороны пластинки, что в сумме равно 14–20 см2. Эти системы не требуют дополнительного оборудования, а процесс отбора проб практически не занимает времени. Однако при этом методе площадь для отбора проб ограничена.

Тампоны, салфетки и губки используются как инструменты для непрямого отбора проб. Ими протирают исследуемую поверхность и затем опускают в буферный раствор, который, в свою очередь, вносят в традиционные чашки Петри с помощью пипетки и распределяют штрихами. При использовании непрямого метода площадь исследуемой поверхности может быть гораздо больше, возможно исследование узких пространств и щелей. Однако у непрямых методов есть и недостаток: процедура более сложная, требуется дополнительное оборудование. Для определения патогенов стандарты ISO рекомендуют отбор проб с поверхности площадью 1000–3000 см2; это возможно только при использовании губок или салфеток.

Методы обнаружения на основе хромогенных жидких сред

Этот метод культивирования позволяет только обнаружить, но не подсчитать определенные организмы или группы организмов, поскольку получить количественный результат невозможно. В методах с применением жидких сред для взятия проб используются тампоны, которые затем помещаются в пробирки с селективной средой. В среднем предварительный отрицательный результат можно получить после инкубации не менее 48 часов. Положительные пробы выявляют по изменению цвета или по флуоресценции обогащенной пробы при определенной длине волны. Такие тесты обычно просты в применении и недороги.

Недостатком систем на основе жидких сред является их низкая чувствительность вследствие применения высокоселективных сред, в которых намеренно подавляется рост других бактерий. С этим связан определенный риск: бактерии в производственной среде уже находятся в состоянии стресса и могут погибнуть, если среда обогащения слишком селективна. С другой стороны, при слишком низкой селективности может быть сложно обнаружить определенные микроорганизмы используя только селективной жидкую среду. Интерпретация результатов может стать сложной и субъективной, поскольку изменение цвета или флуоресценция не всегда достаточно сильны, чтобы можно было говорить об окончательном результате. Основное преимущество методов на основе жидких сред — их простота в применении и дешевизна.

Методы на основе ДНК

Существует три метода на основе ДНК: изотермическая амплификация ДНК, традиционная ПЦР и ПЦР в режиме реального времени. ПЦР в режиме реального времени хорошо себя зарекомендовала для выявления ДНК или РНК, а изотермическая амплификация — более новая технология. Изотермическая амплификация имеет очевидные преимущества перед ПЦР в режиме реального времени: например, для изотермической амплификации не требуется термоциклер, поскольку реакция протекает при постоянной температуре. Наиболее экономичный, но и наиболее трудоемкий метод — традиционная ПЦР, поскольку необходимо провести гибридизацию или использовать после амплификации довольно неспецифичный краситель для выявления амплифицированной ДНК или РНК.

Во всех методах определенные части ДНК или РНК выявляются при помощи специфичных праймеров, а затем их концентрация увеличивается при помощи фермента полимеразы. Чувствительность этих методов удивительно высока, а регионы-мишени в ДНК или РНК хорошо известны. Основное ограничение этой системы — ее зависимость от ферментов. Для надлежащего функционирования ферментам необходимы специальные буферные растворы. Компоненты дезинфектантов могут повлиять на активность ферментов, что может привести к получению ложноотрицательных результатов. Кроме того, для этого метода необходимо множество действий с микропипетками, что может стать серьезным источником ошибок.

Наибольшее преимущество методов на основе ДНК в том, что благодаря высокой чувствительности метода можно использовать неселективную среду для обогащения. Неселективные среды недороги, выпускаются разными производителями и требуют минимального уровня биобезопасности (уровень 1). Также методы на основе ДНК позволяют обнаружить малые количества патогенов на поверхностях без обогащения, однако чувствительность их низка по сравнению с методами с обогащением. Наконец, серьезной проблемой могут стать ложноположительные результаты из-за наличия фрагментов ДНК уже убитых патогенов.

Иммунологические методы

Иммунологические тесты — это системы, в которых для определения наличия микроорганизмов в растворах используются антитела. Эти антитела способны связываться с антигенами, такими как липополисахариды на поверхности клеток или жгутики определенных микроорганизмов. После одной или множества процедур обогащения с участием селективной среды патогены, такие как клетки Listeria, выявляются с помощью специфичных тест-систем на основе антител.

Первыми методами, где иммунология использовалась для выявления определенных микроорганизмов, стали тесты ИФА (иммуноферментный анализ). ИФА позволяет количественно определить исследуемый аналит, но из-за необходимого этапа обогащения исходную концентрацию вычислить невозможно. Многократные переносы и отмывания, необходимые для ИФА, может выполнять только квалифицированный персонал. Разработка устройств, основанных на принципе растекания жидкости в радиальном направлении (иммунохроматография), или тест-полосок, решило эту проблему, и проводить иммунологические исследования стало гораздо проще и быстрее, без необходимости трудоемкого ИФА. Иммунохроматография с селективными антителами в комбинации с высокоэффективными средами обогащения позволяет быстро получить точные результаты без дорогостоящего оборудования или затрат на обучение.

Заключение

Не всегда легко выбрать правильный метод для санитарно-гигиенического контроля. При принятии решения следует учесть несколько соображений: сколько мест отбора проб необходимо исследовать и насколько важна производительность? Как можно оптимизировать скорость получения результата при том, что исследование на некоторые патогенные бактерии проводится не каждый день и скорее служит для наблюдения, а не для контроля качества? Нужны ли количественные результаты или достаточно качественного определения? Поскольку все еще невозможно подсчитать количество бактерий непосредственно после очистки, производители могут использовать тест-системы для выявления АТФ или белка, которые могут в общих чертах подсказать, безопасно ли приступать к производству, т. е. имеется ли АТФ или белок.

На принятие решения также могут повлиять государственные стандарты. Методы с обогащением ДНК и иммунологические методы превосходят другие технологии по чувствительности и селективности и должны быть методами выбора для обнаружения патогенов. Для выявления и подсчета индикаторных организмов или контроля общего санитарного состояния можно использовать более доступные системы, например погружные слайды или системы на основе АТФ. 

Эта статья была опубликована в нашем журнале SPOT ON.