Desafíos en las pruebas de alérgenos - Picos y recuperaciones

Cuando empecé a desarrollar inmunoensayos para la detección de alérgenos en los alimentos, lo primero que me sorprendió fue la amplia gama de tipos de alimentos o matrices diferentes con los que tenían que trabajar los ensayos. Viniendo de una formación médica en inmunoensayos, había un número limitado de matrices diferentes con las que trabajar. En mi caso, se trataba de suero sanguíneo. Con los alimentos hay una gama casi infinita de tipos de muestras diferentes, cada una con sus propiedades específicas.

¿Cómo elijo el kit de pruebas adecuado?

Entonces, ¿cómo nos aseguramos de que el kit de pruebas producido es adecuado para su uso con una gama de muestras tan diversa y desafiante? Aquí es donde entra en juego la validación de la muestra. El proceso consiste en añadir una cantidad conocida de un alérgeno de interés a nuestra matriz (pico) y luego intentar volver a sacar ese alérgeno (recuperación). Algo importante que hay que recordar es que, como su nombre indica, los inmunoensayos utilizan componentes biológicos (anticuerpos) para lograr la detección de las proteínas alergénicas de interés. Como ocurre con todos los sistemas biológicos, los kits son sensibles a los extremos. En el caso de los alimentos, los kits pueden no funcionar como deberían en presencia de ácidos o álcalis fuertes, mucha sal, mucha grasa, etc. Muchos de estos extremos pueden contrarrestarse durante el proceso de extracción. Por ello, los kits utilizan un sistema tamponado para hacer frente a los cambios de pH y la adición del tampón a la muestra ayuda a reducir y diluir algunos de los otros problemas, como la sal y la grasa.

¿Es aceptable mi recuperación?

Cuando se trata de la recuperación de una cantidad conocida de alérgeno a partir de una matriz de muestra, ¿qué se considera aceptable? Antes de responder a esto, tenemos que definir de dónde partimos. ¿Se trata de una muestra incurrida o de una muestra enriquecida?

Las muestras incurridas se definen como muestras en las que se ha incorporado una cantidad conocida del alérgeno alimentario durante el procesamiento, imitando lo más posible las condiciones reales en las que se fabricaría normalmente la matriz de la muestra.

El tema de las muestras incurridas se tratará con mayor profundidad en un número posterior de Spot On. En este artículo, me centraré en esbozar un método más accesible para introducir una cantidad conocida de alérgeno en una matriz tal y como se recibe del proveedor o fabricante y medir su recuperación.

Con respecto a la recuperación, la guía afirma que:

"Los niveles ideales de porcentaje de recuperación oscilarían entre el 80 y el 120%. Los niveles de recuperación se ven afectados tanto por la eficacia del paso de extracción como por el procedimiento ELISA.

"Con los métodos ELISA para alérgenos alimentarios, este nivel de recuperación no siempre es posible, sobre todo cuando se analizan determinadas matrices difíciles. Además, la recuperación a partir de muestras incurridas puede ser sustancialmente diferente de la obtenida utilizando muestras enriquecidas.

"Por este motivo, las recuperaciones entre el 50 y el 150% se considerarán aceptables siempre que pueda demostrarse que son coherentes."

Las directrices fueron publicadas en 2010 por la Asociación de Comunidades Analíticas (AOAC) con especial referencia a los métodos ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas) cuantitativos. Muchos de los puntos clave también son aplicables a los métodos cualitativos o semicuantitativos LFD (Lateral Flow Device).

La "ciencia" detrás de la adición

Cuando recibamos o nos encontremos con un nuevo tipo de alimento que no haya sido analizado antes, llevaremos a cabo una validación de recuperación de picos para asegurarnos de que funciona como debería con nuestros kits de pruebas. Pondremos picos a tres niveles diferentes de alérgeno -bajo, medio y alto- para cubrir el rango de detección del ensayo.

El pico de alérgeno bajo estará cerca del límite inferior de cuantificación, LLOQ, del ELISA (en este caso el calibrador de valor más bajo por encima de 0 ppm) o cerca del límite de detección, LOD, de un dispositivo de flujo lateral. El pico medio estará en el centro de la curva de calibración del ELISA, y el pico alto estará en o cerca del Límite Superior de Cuantificación, ULOQ (el calibrador de valor más alto en ppm). La muestra se extrae y se analiza de acuerdo con el prospecto del producto suministrado con el kit.

Así, por ejemplo, si pinchamos 5 ppm de almendra en chocolate, esperaríamos ver una recuperación de 4 ppm a 6ppm. Si el resultado está fuera de este rango, entonces hay medidas que pueden tomarse para ayudar a mejorar la recuperación. Por experiencia, el chocolate es una de las matrices alimentarias más difíciles de analizar: está lleno de taninos y otros polifenoles que pueden unirse a cualquier proteína alergénica que pueda estar presente y formar complejos insolubles difíciles de extraer.

Estas dificultades pueden superarse añadiendo proteína extra al tampón de extracción. El exceso de proteína se une a los polifenoles y hace que los alérgenos estén disponibles para la extracción. Mi proteína de elección es la gelatina de pescado, aunque pueden utilizarse otros materiales, como la leche en polvo, para mejorar la eficacia de la extracción de alimentos con alto contenido en polifenoles. Si utiliza leche en polvo, tenga cuidado de no contaminar el espacio de su laboratorio, especialmente si está realizando pruebas de alérgenos lácteos.

Los dispositivos de flujo lateral, o tiras o dipsticks como a veces se les denomina, pueden validarse para la recuperación de picos de forma similar a un kit de prueba ELISA de alérgenos. Lo que hay que tener en cuenta al elegir un nivel de pico alto es que, aunque los LFD son capaces de detectar niveles muy altos de ppm, en realidad se puede sobrecargar el dispositivo añadiendo demasiado alérgeno. Esto puede ocurrir en cantidades superiores al 1% del alimento alergénico.

Mantener la calidad y la precisión de las pruebas

Puede ser necesario que un fabricante de kits trabaje en estrecha colaboración con clientes que realizan pruebas rutinarias de matrices alimentarias difíciles. Es importante verificar que el kit funciona como debe y a satisfacción del cliente. Esto puede lograrse, como se ha detallado anteriormente, realizando experimentos de recuperación de picos de alérgenos en la matriz problemática.

En algunos casos puede ser conveniente modificar o cambiar el método estándar del kit para satisfacer las demandas de la muestra y/o del cliente; esto debe realizarse siempre con la orientación del fabricante del kit para garantizar la calidad y la reproducibilidad del kit de pruebas.